Нормофлора (выращивание, препараты)

Федеральное агентство по здравоохранению и социальному развитию РФ

ГОУ ВПО «САМАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ РОСЗДРАВА»

Кафедра фармацевтической технологии

Реферат

по биотехнологии

Нормофлора (выращивание, препараты)

Исполнитель:

студентка 6 курса 64 группы

Крыпаева Евгения Александровна

Руководитель:

зав. кафедрой

фармацевтической технологии,

доктор фармацевтических наук,

профессор Первушкин С.В.

Самара 2009

Содержание

Введение 3

1.Виды и функции нормальной микрофлоры человека 4

2. Препараты нормофлоры 7

3. Технология получения пробиотиков 11

Заключение 15

Список литературы 16

Введение

Организм человека и населяющие его микроорганизмы являются единой экосистемой. Поверхности кожи и слизистых оболочек тела человека обильно заселены бактериями. При этом количество бактерий, населяющих покровные ткани, во много раз превосходит число собственных клеток хозяина. Количественные колебания бактерий в биоценозе могут достигать для некоторых бактерий нескольких порядков и, тем не менее, укладываются в принятые нормативы [3].

В организме человека в соответствии с условиями обитания формируются биотипы с определенными микробиоценозами. Любой микробиоценоз- это сообщество организмов, существующее как единое целое, связанное цепями питания и микроэкологией.

Нормальная микрофлора (нормофлора) - это совокупность множества микробиоценозов, характеризующихся определенными взимосвязями и местом обитания.

Велика защитная роль нормофлоры в обеспечении здоровья, поэтому нарушение равновесия между отдельными видами микроорганизмов в местах их постоянного обитания за счет более интенсивного размножения или гибели какого-либо вида может повлечь нарушение гомеостаза с соответствующими последствиями патологического характера.

При определенных условиях микрофлора человека может оказать неблагоприятное влияние на жизнедеятельность и состояние организма человека. Возможно возникновение гнойно-воспалительных реакций, сенсибилизации организма со многими клиническими проявлениями аллергического порядка, формирование в организме банка плазмид и генов с проявлениями мутагенной и антимутагенной активности.

1. Виды и функции нормальной микрофлоры человека

Существует два вида нормальной микрофлоры:

1)резидентная – постоянная, характерная для данного вида. Количество характерных видов относительно невелико и относительно стабильно. Резидентная микрофлора обнаруживается в определенных местах тела человека, при этом важным фактором является его возраст;

2)транзиторная – временно попавшая, не характерная для данного биотопа; она активно не размножается, поэтому, хотя видовой состав транзиторных микроорганизмов и разнообразен, но они не являются многочисленными. Характерная особенность этого вида микрофлоры заключается в том, что, попадая на кожу или слизистые оболочки из окружающей среды, не вызывает заболеваний и не обитает постоянно на поверхностях тела человека.

Она представлена сапрофитными условно-патогенными микроорганизмами, которые обитают на коже или слизистых оболочках в течение нескольких часов, дней или недель. Присутствие транзиторной микрофлоры определяется также состоянием иммунной системы организма хозяина [8].

Состав транзиторной микрофлоры не является постоянным и зависит от возраста, внешней среды, условий труда, рациона питания, перенесенных заболеваний травм и стрессовых ситуаций.

Нормофлора формируется с рождения, заселение ее бактериями продолжается в течение всей жизни. При качественный и количественный состав нормальной микрофлоры регулируется сложными антагонистическими и синергическими отношениями между отдельными ее представителями в составе биоценозов.

В норме многие ткани и органы здорового человека стерильны, в частности кровь, ликвор, суставная жидкость, плевральная жидкость, лимфа грудного протока, внутренние органы. Стерильность обеспечивается неспецифическими клеточными и гуморальными факторами иммунитета, препятствующими проникновению микробов в эти ткани и органы.

На всех открытых поверхностях и во всех открытых полостях формируется относительно стойкая микрофлора, специфичная для данного органа, биотипа или его участка [1].

Наибольшей обсемененностью характеризуются:

1)толстый кишечник. В составе нормальной микрофлоры преобладают анаэробные бактерии (96-99%), аэробные и факультативно-анаэробные бактерии;

2)ротовая полость. Нормальная микрофлора ротовой полости различна и определяется биологическими особенностями обитающих здесь видов. Представители ротовой полости делятся на три категории:

а)стрептококки, нейссерии, вейлонеллы;

б)стафилококки, лактобактерии, нитевидные бактерии;

в)дрожжеподобные грибы;

3)мочевыделительная система. Нормальная микрофлора наружной части уретры у мужчин и женщин представлена коринебактериями, микобактериями, грамотрицательными бактериями фекального происхождения и неспорообразующими анаэробами (пептококки, пептострептококки, бактероиды).

4)верхние дыхательные пути. Собственная микрофлора носа состоит из коринебактерий, нейссерий, коагулазо-отрицательных стафилококков, α- гемолитических стрептококков. Микрофлора зева более разнообразна из-за смешивания микрофлоры полости рта и воздухоносных путей. В верхних дыхательных путях преобладают стрептококки и нейссерии, встречаются стафилококки, дифтероиды, гемофильные бактерии, пневмококки, микоплазмы, бактероиды;

5)кожа, особенно ее волосистая часть. В связи с постоянным контактом с внешней средой кожа является местом обитания транзиторных микроорганизмов, имея при этом постоянную микрофлору. Состав резидентной микрофлоры кожи и слизистых оболочек характеризуется наличием Staphylococcus epidermis, S. aureus, Micrococcus spp., Sarcinia spp., Propionibacterium spp., коринеформными бактериями.

Нормальная микрофлора рассматривается как самостоятельный экстракорпоральный орган с определенной анатомической структурой и следующими функциями [10].

1.Антагонистическая функция. Нормальная микрофлора обеспечивает устойчивость соответствующих участков тела к заселению случайной, в том числе и патогенной, микрофлорой.

2.Иммуногенная функция. Бактерии, являющиеся представителями номофлоры, постоянно поддерживают иммунную систему в должном состоянии своими антигенами.

3.Пищеварительная функция. Нормальная микрофлора принимает участие в полостном пищеварении за счет своих ферментов.

4.Метаболическая функция. Нормофлора участвует в обмене белков, липидов, уратов, оксалатов, стероидных гормонов, холестерина за счет свих ферментов.

5.Витаминообразующая функция. В процессе метаболизма отдельные представители нормальной микрофлоры образуют витамины.

6.Детоксикационная функция. Нормальная микрофлора обезвреживает образующиеся в организме токсические продукты обмена веществ или организмы, попавшие из внешней среды.

7.Регуляторная функция. Нормальная микрофлора участвует в регуляции газового, водно-солевого обмена, поддержания рН среды.

8.Генетическая функция. Нормофлора является неограниченным банком генетического материала.

2. Препараты нормофлоры

Микроорганизмы, составляющие нормофлору, представляют собой четкую морфологическую структуру в виде биопленки. Толщина ее 0,1 – 0,5мм. В ней содержится от нескольких сотен до нескольких тысяч микроколоний, образующихся как из анаэробных, так и аэробных бактерий [2].

Формирование биопленки создает для бактерий дополнительную защиту. Внутри биопленки бактерии более устойчивы к действию химических и физических факторов, влияющих на состояние нормальной микрофлоры. К ним относятся:

1)эндогенные:

а)секреторная функция организма;

б)гормональный фон;

в)кислотно-основное состояние;

2)экзогенные: условия жизни (климатические, бытовые, экологические).

Любые количественные или качественные изменения типичной для данного биотопа нормофлоры человека, возникающие в результате воздействия на макро- или микроорганизм различных неблагоприятных факторов приводят в дисбактериозу.

Для коррекции дисбактериоза необходимо устранить причину, вызвавшую его, затем использовать эубиотики(пробиотики) и пребиотики и симбиотики.

Пребиотики – это препараты немикробного происхождения, способные оказывать позитивный эффект на организм хозяина через селективную стимуляцию роста или метаболической активности нормальной микрофлоры кишечника, стимулирующие рост и размножение так называемых дружественных человеку бактерий. Это низкомолекулярные углеводы (фруктозо-олисахариды, инулин, лактулоза и др.), которые не должны подвергаться гидролизу пищеварительными ферментами [7].

Основные известные препараты:

- лактулоза – синтетический дисахарид. Микрофлора толстой кишки гидролизует лактулозу до молочной (в основном) и частично до муравьиной и уксусной кислот. Она способствует понижению рН содержимого толстого кишечника, снижению концентрации гнилостных бактерий, стимулирует перистальтику кишечника и усиливает рост бифидо- и лактобактерий;

- кальция пантотенат участвует в процессах ацетилирования и окисления в клетках, углеводном и жировом обменах, синтезе ацетилхолина, стимулирует образование кортикостероидов в коре надпочечников;

- лизоцим способствует нормализации нарушений микрофлоры. наиболее активен в отношении грамположительных патогенных и условнопатогенных бактерий. Лизоцим обладает бифидогенным, имунномоделирующим, противовоспалительным действием, улучшает пищеварение, стимулирует метаболические процессы и эритропоэ, проявляет синергизм со многими антибиотиками.

Симбиотики – комплексные препараты, содержащие пробиотик и пребиотик [4].

Пробиотеки – это препараты нормальной микрофлоры человека. пробиотики имеют в своем составе живые клетки специально подобранных штаммов микроорганизмов растительного или животного происхождения; они выживают в условиях кишечного окружения, непатогенны, нетоксичны, стабильны в течение длительного срока хранения.

Механизм положительного влияния пробиотиков включает:

- подавление микробных патогенов за счет продукции антибактериальных веществ, конкуренции за лимитируемые питательные вещества и сайты адгезии на кишечной стенке;

- влияние на ферментативную активность кишечных микроорганизмов;

- стимуляцию иммунной системы макроорганизма.

В России производят в основном моновалентные препараты: бифидумбактерин (на основе Bifidobacterium bifidum), апилак (на основе Lactobacillis acidophillus), колибактерин (на основе кишечной палочки E. Coli M-17), лактобактерин (на основе Lactobacillus plantarum, fermentum). комплексные препараты, например бификол (Bifidobacterium и E. Coli M -17). За рубежом производя поливалентные (комплексные) препараты: симбиофтор, бификор, примадофилюс (содержит комплекс микроорганизмов симбионтов) и другие.

Они предназначены в основном для профилактики и лечения дисбактериоза. Особенно широко применяют в клинике детских болезней (при острой дизентерии, сальмонеллезе, эшерехиозе, вирусных диареях, диатезе и др.). При несформировавшейся микроэкологической системы ЖКТ у детей применение препаратов пробиотиков оказывается очень эффективным.

Препараты пробиотиков также применяют в комплексном лечении кишечных инфекций, энероколитах на фоне нарушения микрофлоры с дефицитом или полным отсутствием бифидофлоры и др.).

Пробиотики также назначаются ослабленным людям после соматических заболеваний и по завершении лечения антибиотиками, лицам преклонного возраста, так как у них в связи с изменением гормонального статуса уменьшается количество бифидо- и лактобактерий.

Действующим началом лактосодержащих препаратов являются живые лактобациллы, обладающие антагонистическим действием против широкого спектра патогенных и условнопатогенных бактерий за счет продукции кислот, перекиси водорода, лизоцима и антибиотическихвеществ. локтобациллы выделяют ферменты, витамины, способствуют пищеварению, улучшают обмен веществ, обладают иммуномоделирующим действием, нормализуя естественную резистентность организма. Лактосодержащие препараты целесообразно назначать детям и взрослым при лечении ОКИ, хрогических заболеваниях ЖКТ с выраженными дисбиотическими явлениями, особенно в случае дефицита лактофлоры или при использовании этих препаратов в комбинированной терапии с антибиотиками [5].

К лактосодержащим препаратам относится лактобактерин, апилакт, аципол, линекс, гастрофарм, биобактон.

Среди колисодержащих препаратов следует отметить колибактерин, лечебное действие которого обусловлено антагонистической активностью кишечной палочки в отношении патогенных и условнопатогенных микроорганизмов, включая шингеллы, сальмонеллы, протей и др., бификол и бифилор.

Препараты из апатогенных представителей других таксономических групп или микробных метаболитов. В этой группе относятся препараты из апатогенных представителей родов Bacillus, Aerococcus и Saccharomyces. Из спорообразующих бацилл готовят препараты бактисубтил, споробактерин, бактиспорин и биоспорин. Лечебное свойство споровых препаратов обусловлено их выраженными антагонистическими свойствами против широкого спектра патогенных и условнопатогенных бактерий, в том числе протеев, стафилококков и грибов рода Candida. Эти препараты содержат комплекс ферментов, стимулирующих пищеварение, способствуют лучшему усвоению пищи, содержат протеолитические и фибринолитические ферменты, чем способствуют очищению воспалительных очагов от некротических тканей. Наиболее известный представитель этой группы – это препарат Хилак-форте. Он содержит концентрат продуктов метаболизма бактерий тонкой и толстой кишки, в том числе метаболиты Lactobacillus acidophilus, L.helveticus, E-coli, Enterococcus faecalis, молочную и фосфорную кислоты, аминокислоты и другие вещества, способствущие нормализации рН, восстановлению водно-электролитного баланса, состава нормофлоры и поддержанию физиологической функции слизистой оболочки кишечника.

3. Технология получения пробиотиков

Необходимым условием массового производства препаратов пробиотиков является сохранение их стабильности в течение длительного времени. Бактерийные препараты, содержащие живые организмы, относятся к наименее стойким. На выживаемость микроорганизмов в сухих препаратах влияют следующие факторы:

- регламентированное содержание остаточной влаги;

- наличие защитных сред;

- хранение сухих препаратов в атмосфере, не содержащей кислород.

В целях защиты пробиотиков от кислой среды желудка на таблетированные и капсулированные формы наносят ацидорезистентные покрытия или проводят иммобилизацию бактерий на сорбенте.

Для получения препаратов пробиотиков необходимо иметь штаммы микроорганизма симбионта. Их выделяют из кишечного содержимого здоровых детей и взрослых. Эти штаммы должны обладать следующими свойствами:

- наличие полезного воздействия на организм хозяина, подтвержденным лабораторными исследованиями и клиническими наблюдениями;

- штаммы должны быть идентифицированы с учетом генетических признаков так как для получения пробиотиков разрешены штаммы только определенных видов микроорганизмов;

- при длительном использовании они не должны вызывать побочных эффектов. Штаммы не должны быть непатогенными и нетоксичными;

- наличие колонизационного потенциала, то есть сохранение в пищеварительном тракте до достижения максимального положительного действия (должны быть устойчивы к низким значениям рН, желчным кислотам, антимикробной субстанциям, продуцируемым индогеннлй микрофлорой с адгезией к эпителию соответствующих слизистых оболочек);

- наличие выраженной антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам;

- наличие стабильных характеристик как в клиническом, так и в технологическом плане;

- наличие высокой скорости роста и размножения в условиях, близких к таковым в кишечном тракте;

- штаммы молочнокислых палочек должны продуцировать преимущественно L(+) – изомер молочной кислоты;

- при введении в больших количествах они должны обладать минимальной способностью к транслокации из просвета пищеварительного тракта во внутреннюю среду макроорганизма;

- наличие четкой физиолого-биохимической и генетической маркировки как для исключения фальсификации, так и для периодического контроля идентичности свойств исходных и производственных культур.

Удовлетворяющие всем этим требованиям штаммы поступают в контрольный институт, откуда их передают в фармацевтическое производство с соответствующими документами, отражающими их характеристики [6].

В заводских лабораториях штаммы высеивают на искусственные питательные среды, проверяют их соответствие паспортным данным (род, вид, биологические свойства). После этого их используют для получения препаратов пробиотиков. В условиях промышленного производства эти штаммы рассеивают и получают отдельные колонии, которые затем пересевают на агаризированные или жидкие питательные среды (например, молочнокислые бактерии хорошо растут в обезжиренном молоке).

Бифидобактерии, лактобациллы, энтерококки – это ауксотрофы. Они не могут сами синтезировать аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, витамины, поэтому их должна содержать питательная среда, в которой они выращиваются. Для культивирования этих бактерий используется сырье, разрешенное в пищевой промышленности, так как препарат, выращенный на этих средах, используется для внутреннего применения.

Источником аминокислот обычно служит белок молока (казеин), который гидролизуют с помощью ферментов (трипсина и пепсина) и получают, соответственно триптол или пептол. Как источник витаминов, а также пиримидиновых и пуриновых оснований используют дрожжевой экстракт, который получают из дрожжей Saccharomyces (пивных либо пекарстких). В качестве микроэлементов используют соли магния, марганца, цинка, которые добавляют в питательную среду для культивирования молочнокислых бактерий. Источником энергии служит лактоза или глюкоза.

Молочнокислые бактерии культивируют от 8 до 16часов, собирают штаммы в той фазе роста, при которой выживание клеток будет наиболее длительным. Это обеспечит длительное хранение полученного препарата.

После процесса культивирования получают бактериальную суспензию, содержащую в 1 мл 109 и более клеток. Эти клетки собирают, используя поточные центрифуги или сепараторы, в которой образуется похожая на сметану с кремовым оттенком масса со специфическим запахом кислого молока. Раствор криопротекторов (вещества белковой природы - обезжиренное молоко или желатин, углеводы – лактоза, сахароза) добавляют в проточную массу и получают густую суспензию клеток, которую разливают в ампулы.

Затем их замораживают в жидком азоте и подвергают лиофильной сушке. Сухая масса приобретает пузырчатый вид. Ее измельчают и определяют титр, в соответствии с которым вносят во флаконы или смешивают с культурой другого штамма.

Для увеличения сроков жизнеспособности бактерий показана сублимационная сушка, проходящая в условиях низкой температуры (-400ºС) и глубокого вакуума.

Укупорку сухих биопрепаратов в виду их гигроскопичности производят под вакуумом или в токе инертного газа.

Форма выпуска – флаконы (бифидумбактерин), или ампулы (бификол), или капсулы («Нутролин В»), или пакетики (бифидумбактерин фирмы «Партнер»).

Заключение

Нормальная микрофлора кишечника в процессе эволюции приобрела исключительно важную роль в формировании колонизационной резистентности организма.

Одним из главных механизмов защиты от колонизации условно-патогенными и патогенными бактериями является присутствие в организме достаточного количества собственной полезной микрофлоры.

Нормальная микрофлора кишечника играет важную роль в конверсии желчных пигментов м желчных кислот, абсорбции питательных веществ и продуктов их расщепления. Ее представители продуцируют аммиак и другие продукты, которые могут адсорбироваться и участвовать в развитии печеночной комы.

Нормофлора кишечника выполняет и регулирует многие функции организма, которые можно уподобить работе лаборатории, осуществляющей многие сотни биохимических процессов.

Поэтому очень важно поддерживать нормальную работу микрофлоры организма человека.

Список литературы

Альбертс Б. Молекулярная биология клетки: Пер. с англ. / Б. Альбертс, Д. Брей, Дж. Льюис. – М.: Мир, 1994. – Т.1. – 515с.

Барзашка – Попова С.Н. Коррекция микрофлоры кишечника при дисбактериозе с помощью лактобацилл / С.Н. Барзашкина-Попова: Автореф. Дис. …к.б.н. – М., 1990. – 22с.

Биотехнология: Учебное пособие для вузов / Под. ред. Н.С. Егорова. – М.: 1987.

Качура В.И. Способы высушивания молочнокислых бактерий // Виноделие и виноградорство СССР.- 1985. – №2. – С. 49-50.

Михайлов И.Б. Клиническая фармакология / И.Б. Михайлов. – СПб., 1998. – 473с.

Промышленная технология лекарств: В 2-х т. / Под. ред. В.И. Чуешова. – Харьков: НФАУ, МТК-книга, 2002, - Т.1. – 557с.; Т.2. – 714с.

Северин С.Е. Биохимия и медицина – новые подходы и достижения / С.Е. Северин. – М.: Русский врач, 1998. – 94 с.

Сорокулова И.Б., Белявская В.А. Рекомбинантные пробиотики: проблемы использования в медицине и ветеринарии.//Вест.Рос. АМН. – 1997. - №3 – с.17-19.