Механізми розвитку тубуло-інтерстиційного синдрому при хронічному нефриті Мазугі
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О.БОГОМОЛЬЦЯ
ДІКАЛ МАР’ЯНА ВІКТОРІВНА
УДК 616.61-002.2:616-008.6
МЕХАНІЗМИ РОЗВИТКУ ТУБУЛО-ІНТЕРСТИЦІЙНОГО СИНДРОМУ ПРИ ХРОНІЧНОМУ НЕФРИТІ МАЗУГІ
(експериментальне дослідження)
14.03.04 –патологічна фізіологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Київ - 2008
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у Буковинському державному медичному університеті МОЗ України
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор
Роговий Юрій Євгенович,
Буковинський державний медичний університет,
професор кафедри фізіології
Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор
Гоженко Анатолій Іванович,
Одеський державний медичний університет,
завідувач кафедри загальної та клінічної патологічної
фізіології
доктор медичних наук, професор
Кришталь Микола Васильович,
Національний медичний університет
ім. О.О. Богомольця,
професор кафедри патологічної фізіології
Захист відбудеться “20“травня“ 2008 р. о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, м.Київ, вул. Богомольця, 4.
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою:01024,м.Київ, вул. Богомольця, 4.
Автореферат розісланий “18“квітня“ 2008 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01
доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.
Загальна характеристика роботи
Актуальність теми. Хронічний гломерулонефрит – це найбільш важке захворювання нирок, яке займає одне із перших місць серед причин розвитку хронічної ниркової недостатності. Сповільнення прогресування даного захворювання є однією із найбільш важливих проблем практичної нефрології (Лапчинська І.І., 2006; Смирнов А.В., 2002). У зв’язку з цим особливий інтерес викликає дослідження патогенетичних механізмів розвитку, прогресування хронічного гломерулонефриту, методи лікування та попередження розвитку і сповільнення прогресування хронічної ниркової недостатності (Корякова Н.Н., 2005; Мойсеєнко В.О., 2004).
Серед механізмів прогресування хронічного гломерулонефриту важливе значення надається розвитку тубуло-інтерстиційного синдрому, який характеризується первинним ураженням клубочків нирок з подальшим залученням до патологічного процесу канальців та інтерстиція (Чеботарева Н.В., 2006). Зміни, які відбуваються в канальцях нирок при більшості захворювань проявляються пошкодженням проксимального відділу нефрону, дисфункція якого носить універсальний характер (Вашурина Т.В., 2003; Шулутко Б.И., 2004).
Значну роль у пошкодженні канальців та інтерстицію при хронічному нефриті Мазугі відіграють ряд факторів: ішемія тубулярного епітелія та інтерстиційних клітин, гіперамоніогенез із дифузією молекул NH>4>+ в тканини нирок, процеси пероксидного окиснення ліпідів (Команденко М.С., 2000; Синяченко О.В., 2006), утворення в канальцях вільних радикалів кисню, дифузія їх в інтерстицій і активація фібробластів, перевантаження канальців білком призводить до розвитку їх дисфункції (Шишкин А.Н., 2005; Mackinnon В., 2005). Важливим фактором вважається протеїнурія, яка розвивається внаслідок порушення реабсорбції молекул білка через тубулярні клітини, які токсично впливають на клітини проксимальних канальців, порушуючи їх метаболізм та ушкоджуючи структуру з розвитком запалення, яке трансформується в патологічний процес інтерстицію (Gekle М., 2005; Iseki К., 2003).
Продукція цитокінів пошкодженими нефронами, а саме фактора некрозу пухлин-, трансформуючого фактора роста-, активація макрофагів і стимуляція колагеногенезу, із розвитком нефросклерозу (Паунова С.С., 2005; Самусеева Е., 2005; Zhang C., 2005), активація ренін-ангіотензинової системи сприяє формуванню хронічного патологічного процесу (Синяченко О.В., 2006; Antoine А.М., 1997; Border W.A., 1998).
Загальні закономірності патогенезу тубуло-інтерстиційного синдрому встановлені на прикладі моделі сулемової нефропатії в поліуричну стадію розвитку патологічного процесу (Роговий Ю.Є., 2000). Водночас особливості розвитку тубуло-інтерстиційного синдрому за хронічного нефриту Мазугі на рівні кіркової, мозкової речовини та сосочка нирок з аналізом особливостей структурних, гістоензимохімічних змін нирок, виясненням ролі пероксидного окиснення ліпідів, антиоксидантного захисту, фібринолізу, протеолізу, фактора некрозу пухлин альфа практично не досліджені. Це склало основу для проведення наших досліджень.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота проводилася в рамках науково-дослідницької роботи кафедр медичної хімії та патологічної фізіології Буковинського державного медичного університету “Дослідження порушень водно-електролітного обміну, закономірностей центральних стресіндукованих та ішемічних дисфункцій, паренхіматозно-стромального дисбалансу при ушкодженні внутрішніх органів за умов впливу екологічно несприятливих чинників з розробкою шляхів корекції виявлених патологічних змін” номер державної реєстрації 01.04 V 009029, IH. 09.00.001.04. Дисертант є співвиконавцем зазначеної теми, в якій дослідила можливі механізми розвитку тубуло-інтерстиційного сидрому при експериментальному нефриті Мазугі, функціональний стан нирок, стан системи тканинного фібринолізу та протеолізу, пероксидне окиснення ліпідів, окиснювальну модифікацію білків, антиоксидантну систему, елементи сполучної тканини та цитокіни. Провела експериментальне патогенетичне обгрунтування застосування фібринолітичного препарату урокінази та імуномодулятора GA-40.
Мета дослідження. З’ясувати механізми розвитку тубуло-інтерстиційного синдрому із патогенетичним обгрунтуванням лікування даного патологічного процесу при хронічному нефриті Мазугі.
Завдання дослідження:
1. Вивчити функціонально-біохімічний стан нирок та взаємозв’язки між показниками функції нирок при хронічному нефриті Мазугі.
2. Дослідити роль пероксидного окиснення ліпідів, ферментів антиоксидантного захисту, окиснювальної модифікації білків, фактора некрозу пухлин-альфа, оксипроліну в патогенезі розвитку тубуло-інтерстиційного синдрому за умов хронічного патологічного процесу нирок.
3. Вивчити значення необмеженого протеолізу, тканинного фібринолізу та енергообміну на моделі прогресуючої ниркової недостатності в механізмах розвитку поєднаної патології ниркових канальців та інтерстицію.
4. Вивчити морфологічну та гістоензимохімічну характеристику моделі прогресуючої ниркової недостатності при експериментальному хронічному нефриті Мазугі.
5. Дослідити патогенетичну роль урокінази та препарату GA-40 як засобів лікування тубуло-інтерстиційного синдрому за хронічного нефриту Мазугі.
Об’єкт дослідження: патогенез хронічної ниркової хвороби.
Предмет дослідження: тубуло-інтерстиційний синдром за хронічного нефриту Мазугі.
Методи дослідження: Експериментальні - моделювання тубуло-інтерстиційного синдрому; фізіологічні – функціональні показники діяльності нирок (діурез, кількість випитої рідини, екскреція креатиніну, іонів натрію, калію, білка, клубочкова фільтрація, проксимальна, дистальна реабсорбція іонів натрію, відносна реабсорбція води); біохімічні – визначення малонового альдегіду, дієнових кон’югатів, активності супероксиддисмутази, каталази, глутатіонпероксидази, окиснювальної модифікації білків, оксипроліну, білка за методом Лоурі; хімічні – визначення іонів натрію, калію; гістоензимохімічні – визначення активноті сукцинатдегідрогенази та лужної фосфатази; гістологічні – (забарвлення зрізів нирок: гематоксилін-еозин, PAS-реакція, Слінченко); імуно-ферментні - визначення фактора некрозу пухлин-; статистичні – визначення середньої арифметичної, стандартної похибки, показника достовірності, кореляційний, регресійний та багатофакторний регресійний аналіз.
Наукова новизна одержаних результатів. У дисертації вперше встановлений патогенез тубуло-інтерстиційного синдрому як основи розвитку хронічного та швидко-прогресуючого патологічного процесу в кірковій, мозковій речовині та сосочку нирок за умов хронічного нефриту Мазугі. Вперше показано при розвитку тубуло-інтерстиційного синдрому за хронічного нефриту Мазугі наявність фіброзної трансформації інтерстиційних клітин ІІ типу сосочка нирок. Вперше встановлено, що активація сукцинатдегідрогенази в дистальному відділі нефрону за хронічного нефриту Мазугі супроводжувалася адекватною тенденцією до зростання транспорту іонів натрію в цьому відділі ниркових канальців. За умов формування тубуло-інтерстиційного синдрому вперше біохімічно обгрунтовано розвиток вторинної деструкції сполучної тканини. Вперше показано, що хронічний гломерулонефрит Мазугі супроводжується зростанням концентрації фактора некрозу пухлин-альфа в плазмі крові і сечі, який при цьому негативно корелює з проксимальною реабсорбцією іонів натрію та супроводжується атрофією канальців нефрону, що пояснюється активацією процесів апоптозу за участю даного фактора. Вперше встановлено захисний вплив урокінази на розвиток тубуло-інтерстиційного синдрому за хронічного нефриту Мазугі, що проявляється підсиленням протеолізу, фібринолізу плазми крові, зменшенням ступеня інтерстиційного фіброзу, зростанням проксимальної та дистальної реабсорбції іонів натрію, зниженням величини протеїнурії, поліпшенням кислотовидільних процесів у канальцях нефрону. Вперше показано, що препарат GA-40 в умовах розвитку тубуло-інтерстиційного синдрому при хронічному нефриті Мазугі проявляє захистний вплив на збалансованість регуляторних процесів в кірковій речовині та сосочку нирок, що проявляється в попередженні розростання сполучної тканини в інтерстиції нирок, запобігає процесам обтурації на рівні ниркового сосочка та гальмує розвиток гломерулосклерозу.
Практичне значення одержаних результатів. Доведена ефективність застосування урокінази та препарату GA-40 з метою профілактики та лікування тубуло-інтерстиційного синдрому. В даній роботі вперше виявлений захисний вплив урокінази на розвиток тубуло-інтерстиційного синдрому за хронічного нефриту Мазугі з підсиленням протеолізу, фібринолізу плазми крові, зменшенням ступеня інтерстиційного фіброзу, зростанням проксимальної та дистальної реабсорбції іонів натрію, зниженням величини протеїнурії, поліпшенням кислотовидільних процесів у канальцях нефрону, що дає можливість рекомендувати цей препарат для проведення апробації в клінічній практиці в хронічному періоді гломерулонефриту з метою профілактики та лікування тубуло-інтерстиційного синдрому.
Виявлений захисний вплив препарату GA-40 за умов розвитку тубуло-інтерстиційного синдрому за хронічного нефриту Мазугі в збалансованості регуляторних процесів у кірковій речовині та сосочку нирок, що проявляється в попередженні розростання сполучної тканини в інтерстиції нирок, запобігає процесам обтурації на рівні ниркового сосочка та гальмує розвиток гломерулосклерозу.
Для ранньої і більш точної діагностики ниркового тубуло-інтерстиційного синдрому на основі дослідження біопсійного матеріалу доцільно визначати вміст оксипроліну як маркера розростання сполучної тканини та активності сукцинатдегідрогенази в кірковій речовині нирок як кількісного критерію пошкодження ниркових канальців (Деклараційний патент 18785).
Особистий внесок здобувача. Здобувачем визначена мета та завдання даного дослідження, проаналізована наукова література з обраної теми. Особисто проведені всі біохімічні дослідження, аналіз та узагальнення результатів дослідження, написані всі розділи роботи, сформульовані висновки і практичні рекомендації, які відображені в опублікованих роботах. Тексти всіх публікацій написані здобувачем особисто. У наукових розробках, що висвітлені в статтях, опублікованих сумісно з співавторами, участь здобувача полягала в проведенні літературного пошуку, лабораторних досліджень, статистичній обробці отриманих даних, формулюванні висновків та підготовці публікацій до друку.
Апробація результатів дослідження. Результати досліджень, що включені до дисертації, доповідались на Всеукраїнській науково-практичній конференції “Проблеми діагностики, профілактики та лікування екзогенних та ендогенних інтоксикацій” (м.Чернівці, БДМА, 2004 р.); Науковій конференції III читання ім.В.В.Підвисоцького (м.Одеса, 2004 р.); IV Національному конгресі патофізіологів України “Фундаментальні аспекти сучасної медицини” (м.Чернівці, 2004 р.); Міжнародній студентській науковій конференції “Молодь-медицині майбутнього” (м.Одеса, 2005 р.); Міжнародній науково-практичній конференції “Сучасні проблеми медичної та клінічної біохімії” (м.Чернівці, 2005 р.); 67 Всеукраїнській науково-практичній конференції студентів та молодих вчених, присв’яченій 75-й річниці з дня заснування ДонДМУ ім.М.Горького “Актуальні питання клінічної, експериментальної, профілактичної медицини та стоматології” (м.Донецьк, 2005 р.); Науково-практичній конференції з міжнародною участю “Оздоровчі ресурси Карпат і прилеглих регіонів” (м.Чернівці, 2005 р.); Міжнародній науково-практичній конференції “Хронобіологія і хрономедицина: теоретичні та клінічні перспективи” (м.Чернівці, 2006 р.); XVII З’їзді фізіологів України (м.Чернівці, 2006 р.).
Публікації. За матеріалами досліджень опубліковано 10 наукових праць, з них 6 – статті у фахових наукових журналах, рекомендованих ВАК України, де можуть публікуватися матеріали кандидатських та докторських дисертацій (2 одноосібні); 2 роботи - тези в матеріалах і збірниках конференцій та конгресів, отримано 2 патенти України.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалу і методів дослідження, чотирьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення одержаних результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел (151 – кирилицею та 161 – латиницею). Дисертація викладена на 178 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 17 таблицями і 53 рисунками та 15-ма актами впровадження.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження. У дослідах на 267 статевозрілих щурах-самцях масою 0,15-0,18 кг та 16 кроликах досліджували функціональний стан нирок, процеси клубочково-канальцевого та канальцево-канальцевого балансу, процеси пероксидного окиснення ліпідів та окисної модифікації білків, стан антиоксидантної системи та роль прозапальних цитокінів у розвитку тубуло-інтерстиційного синдрому при хронічному нефриті Мазугі.
Гломерулонефрит Мазугі моделювали за методом (K.Rother, H. Sarre, 1963) з проведенням дослідження на 45-ту добу після введення щурам нефротоксичної сироватки, що відповідало хронічному періоду розвитку експериментального гломерулонефриту із сформованим тубуло-інтерстиційним синдромом (Б.А.Пахмурний, 1978).
Функція нирок вивчалася за умов водного індукованого діурезу. Водне навантаження (50 мл/кг маси тіла) проводили підігрітою до 37оС водогінною водою за допомогою металевого зонда, який вводили в шлунок. Евтаназію тварин проводили шляхом декапітації під ефірним наркозом. У сечі концентрацію креатиніну визначали за методом Фоліна (Е.Б.Берхин, Ю.И.Иванов, 1972), у плазмі крові - за методом Поппера у модифікації А.К.Мерзона (1970); концентрацію білка в сечі визначали сульфосаліциловим методом (А.І. Міхеєва, І.А.Богодарова, 1969), вміст кислот, що титруються, та аміаку в сечі визначали титрометрично ( С.И.Рябов и соавт., 1997), концентрацію іонів натрію і калію в плазмі крові та сечі визначали методом фотометрії полум`я з використанням фотометра ФПЛ-1.
На підставі отриманих даних розраховували показники функціонального стану нирок за формулами, наведеними в роботах (О.Шюк, 1981; С.И.Рябов, Ю.В.Наточин, 1997). Проводили кореляційний аналіз між показниками функції нирок за умов хронічного нефриту Мазугі.
У кірковій, мозковій речовині та сосочку нирок визначали показники пероксидного окиснення ліпідів і антиоксидантних систем: дієнові кон’югати за методом (Б.В. Гаврилов, М.И.Мишкорудная, 1983), малоновий альдегід за методом (И.Д.Стальная, Т.Г.Гаришвили, 1977), активність супероксиддисмутази [КФ 1.15.1.1.] за методом (С.Чевари, И.Чаба, Й.Секей, 1985), активність каталази [КФ 1.11.1.6.] за методом (М.А.Королюк, Л.И.Иванова, И.Г.Майорова, В.Е.Токарев, 1988) і активність глутатіонпероксидази за методом (І.Ф.Мещишен, В.П.Пішак, Г.П.Копильчук, 1994). Білок в тканинах визначали за методом (O.H.Lowry, N.I. Rosebrough, A.L.Parr, R.I. Randwall, 1951). Вміст окисно- модифікованих білків у плазмі кров та гомогенатах тканин визначала за реакцією з 2,4-динітрофенілгідразином з утворенням гідразонів характерного спектру поглинання (І.Ф.Мещишен, В.П.Польовий, 1999).
Cтан енергетичного обміну оцінювали за активністю сукцинатдегідрогенази [КФ 1.3.99.1], яку визначали за методом (Ю.М.Торчинский, 1959) в модифікації (А.И.Гоженко, 1974). Кількісну оцінку ступеня колагеногенезу в кірковій речовині нирок проводили за визначенням вмісту оксипроліну (H. Stegeman, 1958).
Тканинний фібриноліз в нирках та сечі оцінювали за визначенням лізису азофібрину з оцінкою сумарної (СФА), неферментативної (НФА) (інкубація проб в присутності блокатора ферментативного фібринолізу -амінокапронової кислоти) з розрахунком ферментативної фібринолітичної активності (О.Л.Кухарчук, 1996). Стан необмеженого протеолізу в кірковій, мозковій речовині нирок та сечі оцінювали за лізисом азоальбуміну, азоказеїну та азоколу (В.П.Пішак 1998).
Імуноферментні дослідження проводились за допомогою стандартних наборів “Amersham” (Англія) та “Immuno Nuclear Corporation” (США) для визначення концентрації ФНП-.
З гістологічних методів використовували забарвлення депарафінованих зрізів гематоксилін-еозином, за методом Слінченка (І.Ю.Олійник, 1999), проводили PAS-реакцію (U. Schmidt, M.Horster, 1977).
Гістоензимохімічно в нирках виявляли лужну фосфатазу та сукцинатдегідрогеназу (М.Берстон, 1965).
Корекцію тубуло-інтерстиційного синдрому при хронічному нефриті Мазугі проводили препаратом GA-40 “ALEXIS” (Грузія), (комплекс поліпептидів, виділених з екологічно чистого рослинного матеріалу) щоденно внутрішньом’язево в дозі 2 мкг/кг та урокіназою НВФ “Simko, ltd” (Україна) з питомою активністю 3000 од. Plough/мг білка вводили в черевну порожнину в дозі 5 од. Plough/100 г 1 раз у 3 дні в 0,2 мл дистильованої води впродовж всього періоду розвитку хронічного нефриту.
Весь цифровий матеріал статистично оброблений методами параметричної статистики, включаючи кореляційний, регресійний та багатофакторний регресійний методи аналізу за допомогою програм “Statgrafics” та “Excel 7.0” та “Statistica”. Показник вірогідності в таблицях, вказаний тільки для вірогідних відмінностей, на рисунках достовірно відмінні величини (р< 0,05) відмічені відповідними значками. У таблицях кореляційного аналізу, в рівняннях і на рисунках простої та багатофакторної регресійних залежностей представлені результати тільки з вірогідними (р< 0,05) зв`язками.
У розділах одержаних результатів та їх обговоренні наведені дані про дослідження тубуло-інтерстиційного синдрому за хронічного нефриту Мазугі на 45-ту добу після введення кролячої нефротоксичної сироватки, який характеризувався відсутністю змін з боку величини сечовиділення, зростанням концентрації іонів калію в сечі та його екскреції, мала місце тенденція до розвитку гіперкаліємії в плазмі крові (табл. 1). Концентрація креатиніну в сечі та його екскреція мали тенденцію до гальмування. Спостерігалася ретенційна азотемія, на що вказувало зростання концентрації креатиніну в плазмі крові. Клубочкова фільтрація та концентраційний індекс ендогенного креатиніну знижувалися, мав місце розвиток протеїнурії. Оцінка показників транспорту іонів натрію за хронічного нефриту Мазугі показала зростання концентрації іонів натрію в сечі та його екскреції. Концентрація іонів натрію в плазмі крові мала тенденцію до зростання, а фільтраційна фракція та абсолютна реабсорбція іонів натрію характеризувалася тенденцією до гальмування. Відносна реабсорбція іонів натрію знижувалася, зростали концентраційний індекс та кліренс іонів натрію.
Проксимальна реабсорбція іонів натрію характеризувалася тенденцією до гальмування, а дистальна реабсорбція цього електроліту мала тенденцію до зростання. Водночас при разрахунках дистальної реабсорбції іонів натрію на 100 мкл клубочкового фільтрату виявлено достовірне зростання цього показника. Кліренс вільної від іонів натрію води не змінювався.
Таблиця 1
Показники функції нирок на 45-ту добу хронічного нефриту Мазугі в період формування тубуло-інтерстиційного синдрому (xSx)
|
Показники |
Контроль (n=9) |
Нефрит Мазугі (n=15) |
|
Діурез, мл/2 год ∙ 100 г |
3,610,203 |
3,680,315
|
|
Концентрація іонів калію в сечі, ммоль/л |
6,330,629 |
11,031,517 P< 0,05 |
|
Екскреція іонів калію, мкмоль/2 год ∙ 100 г |
15,552,326 |
58,0017,694 P< 0,05 |
|
Концентрація креатиніну в плазмі крові, ммоль/л |
57,771,790 |
73,462,813 P< 0,001 |
|
Клубочкова фільтрація, мкл/хв ∙100 г |
727,7110,23 |
464,653,92 Р< 0,05 |
|
Екскреція білка, мг/100 мкл C>cr> |
0,010,002 |
0,030,006 P< 0,05 |
|
Екскреція іонів натрію, мкмоль/2 год ∙ 100 г |
2,430,201 |
4,700,877 p< 0,05 |
|
Проксимальна реабсорбція іонів натрію, ммоль/2 год ∙ 100 г |
10,721,736 |
6,880,828
|
|
Дистальна реабсорбція іонів натрію, мкмоль/100 мкл C>cr> |
0,560,059 |
0,890,058 p< 0,01 |
|
Кліренс іонів натрію, мл/2 год ∙ 100 г |
0,010,001 |
0,030,006 p< 0,05 |
p- вірогідність різниць порівняно з контролем; n-число спостережень.
Дослідження кислоторегулювальної функції нирок за умов хронічного нефриту Мазугі на 45-ту добу розвитку патологічного процесу показало наступне. Екскреція кислот, що титруються, та іонів амонію зростали. Водночас амонійний коефіцієнт змін не зазнавав. Концентрація іонів водню в сечі зростала, а його екскреція характеризувалася тенденцією до збільшення. Водночас стандартизована екскреція іонів водню за швидкістю клубочкової фільтрації зростала вірогідно. Крім того, екскреція кислот, що титруються та іонів амонію, розраховані на 100 мкл клубочкової фільтрації також зростали.
У кірковій речовині нирок у цей час виявлено інфільтрацію строми, клубочків та перигломерулярного простору клітинними елементами, дистрофічні зміни проксимальних канальців (рис. 1).
За хронічного нефриту Мазугі встановлено наявність тубуло-інтерстиційного синдрому в кірковій, мозковій речовині та сосочку нирок, що підтверджено атрофічними та дистрофічними змінами канальців нефрона, наявністю патологічних змін з боку базальних мембран, інтерстицію та явищами інфільтрації строми клітинними елементами, з наявністю тромбозу та фіброзу. За хронічного нефриту Мазугі зі сформованим тубуло-інтерстиційним синдромом внаслідок пошкодження проксимального відділу нефрону – показано зниження фібринолітичної активності у нирках, так як основою тканинної фібринолітичної активності у цьому органі є урокіназа, яка продукується юкстагломерулярним апаратом і проксимальним відділом нефрону, встановлено розростання сполучної тканини, що характеризується переважанням реакцій колагеногенезу над протеолізом (табл. 2). Цим процесам сприяє гальмування реакцій пероксидного окиснення ліпідів, окисно-модифікованих білків (табл. 3) та виснаження активності ферментів антиоксидантного захисту. За цього патологічного процесу на 45-ту добу хронічного нефриту Мазугі встановлено зростання концентрації фактора некрозу пухлин-альфа в сироватці крові з 2,34±0,136 пг/мл в контролі до 11,63±0,885 пг/мл при нефриті, який при цьому негативно корелює з проксимальною реабсорбцією іонів натрію (Фактор некрозу пухлин-альфа = 22,36 – 1,56 проксимальна реабсорбція іонів натрію; r = - 0,936; n= 15; p < 0,001) та супроводжується атрофією канальців нефрону, що пояснюється активацією процесів апоптозу за участю даного фактору (рис. 2).
Таблиця 2
Стан необмеженого протеолізу нирок на 45 добу хронічного нефриту Мазугі за умов формування тубуло-інтерстиційного синдрому (xSx)
|
Показники протеолітичної активності, Е>440>/год/г |
Контроль (n=8) |
Нефрит Мазугі (n=7) |
|
Кіркова речовина: - за азоальбуміном - за азоказеїном - за азоколом |
19,20,58 18,80,76 4,580,560 |
22,11,37 21,60,73 р<0,05 4,780,549 |
|
Мозкова речовина: - за азоальбуміном - за азоказеїном - за азоколом |
31,31,75 32,12,33 5,370,580 |
22,31,54 р<0,01 20,80,83 р<0,001 4,140,260 |
|
Сосочок: - за азоальбуміном - за азоказеїном - за азоколом |
148,914,52
119,311,78
14,653,33 |
97,67,44 р<0,01 81,76,44 р<0,05 7,270,830 |
р> >- вірогідність різниць у порівнянні з контролем, n- число спостережень.
Таблиця 3
Показники окиснювальної модифікації білків у нирках і плазмі крові
на 45 добу хронічного нефриту Мазугі за умов формування тубуло-інтерстиційного синдрому (xSx)
|
Показники ОМБ, Е>370>/год/г |
Контроль (n=9) |
Нефрит Мазугі (n=15) |
|
- кіркова речовина - мозкова речовина - сосочок - плазма крові |
0,140,010
0,050,005
0,0070,0008
0,0190,004 |
0,140,010
0,0850,009 р<0,01 0,0080,0007
0,0050,003 р<0,05 |
р - вірогідність різниць у порівнянні з контролем; n - число спостережень.
Рис.2. Регресійний аналіз між концентрацією фактора некрозу пухлин-альфа в плазмі крові, відносною та проксимальною реабсорбцією іонів натрію на 45-ту добу хронічного нефриту Мазугі в період формування тубуло-інтерстиційного синдрому. r – коефіцієнт кореляції, n-число спостережень, p- вірогідність кореляційного зв’язку.
Препарат GA-40 в умовах розвитку тубуло-інтерстиційного синдрому при хронічному нефриті Мазугі проявляє захистний вплив на збалансованість регуляторних процесів у кірковій речовині та сосочку нирок, що проявляється в попередженні розростання сполучної тканини в інтерстиції нирок, запобігає процесам обтурації на рівні ниркового сосочка та гальмує розвиток гломерулосклерозу. Захисний вплив урокінази на розвиток тубуло-інтерстиційного синдрому за хронічного нефриту Мазугі проявляється підсиленням протеолізу, фібринолізу плазми крові, зменшенням ступеня інтерстиційного фіброзу, зростанням проксимальної та дистальної реабсорбції іонів натрію, зниженням величини протеїнурії, поліпшенням кислотовидільних процесів у канальцях нефрону. Порівнюючи ефективність досліджуваних препаратів, слід відмітити, що урокіназа і препарат GA-40 щодо корекції тубуло-інтерстиційного синдрому за хронічного нефриту Мазугі проявляли приблизно однакову ефективність як засоби профілактики розвитку цього захворювання. Препарат GА-40 взаємодіє з мембранними утвореннями (лектинові рецептори, Т-клітинний рецептор, фосфофоліпіди, глікопротеїди), в результаті цієї взаємодії очевидно відбуваються зміни структури фосфатидилсерину і активація Са2+- незалежної протеїнкінази з класу нових чи атипових і тирозинових протеїнкіназ. Протеїнкіназний шлях викликає активацію транскрипційного фактора NF-kB. Останній включає в себе дві субодиниці з молекулярними масами 50 і 65 kDa, які зв’язані між собою гальмуючою субодиницею IkB. При надходженні активуючого сигналу IkB від’єднується і звільнені субодиниці мігрують в ядро, де зв’язуються зі специфічними послідовностями промоторних ділянок генів-мішеней. Активація цього фактора в кінцевому результаті призводить до збільшення продукції фактора некрозу пухлин-альфа, який виявляє ушкоджувальний вплив на пухлини і виступає засобом саногенетичної дії. З іншого боку за умов хронічного нефриту Мазугі в кірковій речовині нирок навпаки зростає вміст фактора некрозу пухлин-альфа, а під впливом препарату GА-40, який нормалізує гармонію між системами симпатикус-катаболізм-кислотність та парасимпатикус-анаболізм-лужність за участю активації транскрипційного фактору NF-kB, знижується вміст фактора некрозу пухлин-альфа. Ця особливість механізму дії препарату GА-40 характеризує його як імунокоректор нового покоління, який змінює рівень фактора некрозу пухлин-альфа та інших чинників не однонаправлено, а залежно від саногенетичних потреб організму: збільшує рівень цього фактора при злоякісних пухлинах, який потрібний для їх руйнування і знижує його рівень при хронічному нефриті Мазугі, що доцільно з точки зору захисту нефроцитів за цього патологічного процесу від ушкоджувального впливу фактора некрозу пухлин-альфа. На підставі цих особливостей механізму дії GА-40 стає зрозумілим той факт, чому, на відміну від хіміоонкопрепаратів GА-40 не ушкоджує нормальні клітини організму, що й визначає його практично не шкідливу дію на будь-які органи і тканини. Захисний вплив урокінази за умов розвитку тубуло-інтерстиційного синдрому обумовлений стимулюючим впливом на необмежений протеоліз і фібриноліз. Свідченням цього є зростання на фоні введення урокінази лізису азоказеїну, азоколу, азоальбуміну та всіх видів досліджуваної фібринолітичної активності плазми крові. Зменшення концентрації білка в сечі та його екскреції, обумовлене зменшенням ступеня інтерстиційного фіброзу внаслідок активації протеолізу і відновлення процесу в проксимальному відділі нефрону - реабсорбції білка. Зростання проксимальної та дистальної реабсорбції іонів натрію, на фоні застосування урокінази, пояснюється покращенням функції цих канальців внаслідок зменшення ступеня інтерстиційного фіброзу, що обумовлено відновленням необмеженого протеолізу на фоні застосування урокінази. Поліпшення процесів кислотовиділення у ниркових канальцях також зумовлено зменшенням ступеня інтерстиційного фіброзу. Зменшення концентрації та екскреції іонів калію в сечі на фоні застосування урокінази зумовлено нормалізацією функції проксимального відділу нефрону, що викликає зменшення постачання іонів натрію до macula densa. Це зумовлює зниження реактивності тубуло-гломерулярного зворотного зв’язку, гальмування ренін-ангіотензинової системи і, відповідно, призводить до зменшення калійурезу через зниження концентрації альдостерону – головного калійуретичного гормону. Отже, у представленій роботі наведено теоретичне узагальнення та нове вирішення наукової задачі щодо патогенезу тубуло-інтерстиційного синдрому як основи розвитку хронічного та швидко-прогресуючого патологічного процесу в кірковій, мозковій речовині та сосочку нирок за умов хронічного нефриту Мазугі. Гістологічні особливості змін нирок при розвитку тубуло-інтерстиційного синдрому за хронічного нефриту Мазугі характеризуються збільшенням просвіту капсули Шумлянського-Боумена, гіперплазією юкстагломерулярного апарату, інфільтрацією строми та перигломерулярного простору клітинними елементами, дистрофічними та атрофічними змінами ниркових канальців з явищами тромбозу та фіброзу інтерстицію, розширенням просвіту збірних канальців сосочка нирок з фіброзною трансформацією інтерстиційних клітин ІІ типу. Аналізуючи особливість морфологічних змін нирок за хронічного нефриту Мазугі із сформованим тубуло-інтерстиційним синдромом, слід зауважити, що ці зміни є подібними для будь-якого хронічного патологічного процесу в нирках, що відповідає сформованій концепції в літературі як хронічна ниркова хвороба. Все вище сказане узагальнено у вигляді схеми патогенезу тубуло-інтерстиційного синдрому за хронічного нефриту Мазугі, на якій наведено місця захистного впливу досліджуваних препаратів GA-40 та урокінази (рис. 3)
Примітка: ХГНФ –хронічний гломерулонефрит, МДН – маса діючих нефронів, ШКФ – швидкість клубочкової фільтрації, А ІІ – ангіотензин ІІ, РАС- ренін-ангіотензинова система, СДГ- активність сукцинатдегідрогенази, ПОЛ, ПОБ – пероксидне окиснення ліпідів та білків, ТрNa+ - проксимальна реабсорбція іонів натрію, ТdNa+ - дистальна реабсорбція іонів натрію, ФА- фібринолітична активність.
ВИСНОВКИ
У дисертації наведено теоретичне узагальнення та нове вирішення наукової задачі щодо основних механізмів розвитку тубуло-інтерстиційного синдрому за хронічного нефриту Мазугі: хронічна активація ренін-ангіотензинової системи із нефросклерозом та фіброзною трансформацією інтерстиційних клітин ІІ типу сосочка нирок, гальмування активності сукцинатдегідрогенази в проксимальному канальці з порушенням реабсорбції іонів натрію, активація окиснювально модифікованих білків з явищами вторинної деструкції сполучної тканини, ушкодження проксимального канальця фактором некрозу пухлин-альфа.
Хронічна активація ренін-ангіотензинової системи зумовлює гістологічні зміни нирок при розвитку тубуло-інтерстиційного синдрому за хронічного нефриту Мазугі, які характеризуються збільшенням просвіту капсули Шумлянського-Боумена, гіперплазією юкстагломерулярного апарату, інфільтрацією строми та перигломерулярного простору клітинними елементами, дистрофічними та атрофічними змінами ниркових канальців з явищами тромбозу та фіброзу інтерстицію, розширенням просвіту збірних канальців сосочка нирок з фіброзною трансформацією інтерстиційних клітин ІІ типу.
Порушення головного енергозалежного процесу - реабсорбції іонів натрію на 45-ту добу хронічного нефриту Мазугі зі сформованим тубуло-інтерстиційним синдромом пов’язане з гальмуванням активності сукцинатдегідрогенази та лужної фосфатази в проксимальному відділі нефрону.
Активація сукцинатдегідрогенази в дистальному відділі нефрону за хронічного нефриту Мазугі супроводжувалася адекватною тенденцію до зростання транспорту іонів натрію в цьому відділі ниркових канальців з 0,56±0,059 до 0,89±0,058 мкмоль/100 мкл C>cr> (р< 0,01).
Розвиток вторинної деструкції сполучної тканини за умов формування тубуло-інтерстиційного синдрому, про яке свідчить зростання вільного оксипроліну в сечі на 69% (р< 0,001), обумовлений мозаїчністю змін тканинного протеолізу, фібринолізу, пероксидного окиснення ліпідів, антиоксидантного захисту та окиснювальної модифікації білків.
Зростання концентрації фактора некрозу пухлин-альфа в плазмі крові з 2,34±0,136 пг/мл в контролі до 11,63±0,885 пг/мл при хронічному нефриті Ліндемана-Мазугі зумовлює ушкодження проксимального канальця, на що вказує її негативна кореляція з проксимальною реабсорбцією іонів натрію (фактор некрозу пухлин-альфа = 22,36 – 1,56 проксимальна реабсорбція іонів натрію; r = - 0,936; n= 15; p < 0,001), та супроводжується атрофією канальців нефрону, що пояснюється активацією процесів апоптозу за участю даного фактора.
Захисний вплив урокінази на розвиток тубуло-інтерстиційного синдрому за хронічного нефриту Мазугі проявляється підсиленням протеолізу, фібринолізу плазми крові, зменшенням ступеня інтерстиційного фіброзу, зростанням проксимальної та дистальної реабсорбції іонів натрію, зниженням величини протеїнурії з 0,16±0,023 мг/2 год ∙100 г до 0,04±0,008 мг/2 год ∙100 г (p < 0,01), поліпшенням кислотовидільних процесів у канальцях нефрону.
Препарат GA-40 в умовах розвитку тубуло-інтерстиційного синдрому при хронічному нефриті Мазугі проявляє захисний вплив на збалансованість регуляторних процесів в кірковій речовині та сосочку нирок, що проявляється в попередженні розростання сполучної тканини в інтерстиції нирок, запобігає процесам обтурації на рівні ниркового сосочка та гальмує розвиток гломерулосклерозу.
ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ
Виявлений захисний вплив урокінази на розвиток тубуло-інтерстиційного синдрому за хронічного нефриту Мазугі з підсиленням протеолізу, фібринолізу плазми крові, зменшенням ступеня інтерстиційного фіброзу, зростанням проксимальної та дистальної реабсорбції іонів натрію, зниженням величини протеїнурії, поліпшенням кислотовидільних процесів у канальцях нефрону дає можливість рекомендувати цей препарат для проведення апробації в клінічній практиці в хронічному періоді гломерулонефриту з метою профілактики та лікування тубуло-інтерстиційного синдрому.
Виявлений захисний вплив препарату GA-40 за умов розвитку тубуло-інтерстиційного синдрому при хронічному нефриті Мазугі в збалансованості регуляторних процесів у кірковій речовині та сосочку нирок, що проявляється в попередженні розростання сполучної тканини в інтерстиції нирок, запобігає процесам обтурації на рівні ниркового сосочка та гальмує розвиток гломерулосклерозу дає можливість рекомендувати цей лікарський засіб для подальшого доклінічного дослідження з наступним впровадженням у лікувальну практику з метою корекції зазначеної патології.
Для ранньої і більш точної діагностики ниркового тубуло-інтерстиційного синдрому на основі дослідження біопсійного матеріалу доцільно визначати вміст оксипроліну як маркера розростання сполучної тканини, та активності сукцинат-дегідрогенази в кірковій речовині нирок, як кількісного критерію пошкодження ниркових канальців (Деклараційний патент 18785).
Список наукових праць, опублікованих за темою дисертації
1. Пішак В.П., Роговий Ю.Є., Дікал М.В., Магаляс В.М., Бочаров А.В. Біохімічні аспекти дисрегенерації за умов розвитку тубуло-інтерстиційного синдрому // Бук. мед. вісник.-2005.-Т. 9, № 2.- С. 201-203. (Дисертант самостійно провів експериментальні дослідження та статистичну обробку отриманих результатів дослідження).
2. Дікал М.В., Роговий Ю.Є. Роль препарату GA-40 в корекції тубуло-інтерстиційного синдрому при хронічному нефриті Мазугі // Клінічна анатомія та оперативна хірургія.- 2006.- Т. 5, № 3.- С.14-16. ( Дисертант самостійно зробив огляд літератури, експериментальні дослідження та підбір методик).
3. Дікал М.В. Гістологічні особливості тубуло-інтерстиційного синдрому за хронічного нефриту Мазугі // Клінічна та експериментальна патологія.-2006.- Т.5, № 4.- С.30-32.
4. Роговий Ю.Є., Архіпова Л.Г., Дікал М.В., Муравйова І.Л., Філіпова Л.О., Міль К.М., Бойко О.В. Патофізіологічний аналіз дослідження біохімічних параметрів тубуло-інтерстиційного синдрому при хронічному нефриті Мазугі за допомогою вегетативного резонансного тесту “ІМЕДИС-ТЕСТ+”// Одеський медичний журнал.-2006.-Т.98, N 6.- С.14-17. (Дисертант самостійно здійснив експериментальні дослідження та статистичну обробку отриманих даних).
5. Дікал М.В. Функціональні та гістоензимохімічні особливості нирок за умов розвитку тубуло-інтерстиційного синдрому при хронічному нефриті Мазугі // Науковий вісник Ужгородського університету, серія “Медицина”.-2007.- вип.30.-С.43-46.
6. Дікал М.В., Роговий Ю.Є. Роль фактора некрозу пухлин-альфа в патогенезі тубуло-інтерстиційного синдрому за хронічного нефриту Мазугі // Вісник наукових досліджень.-2007.- № 2. - С.108-111. ( Дисертант самостійно зробив огляд літератури, експериментальні дослідження та підбір методик).
7. Деклараційний пат. 18785 Україна, МПК А 61 В 10/02, G 01 N 33/48. Спосіб біохімічної діагностики тубуло-інтерстиційного компонента: .Деклараційний пат. 18785 Україна, МПК А 61 В 10/02, G 01 N 33/48 В.П.Пішак, М.В.Дікал, В.Г.Висоцька, В.М.Магаляс, Ю.В.Ломакіна (Україна).-№200606156. Заявл. 02.06.2006. Опубл.15.11.2006.- Бюл. №11.
8. Деклараційний пат. 8915 Україна, МПК 7 А 61 К 31/515. Спосіб профілактики експериментальної олігоануричної форми гострої ниркової недостатності: Деклараційний пат. 8915 Україна, МПК 7 А 61 К 31/515 М.В.Дікал, В.М.Магаляс (Україна).- №200502839. Заявл. 28.03.2005. Опубл.15.08.2005.- Бюл. №8.
9. Дікал М.В. Діагностики тубуло-інтерстиційного компоненту // “ХИСТ” Всеукраїнський медичний журнал молодих вчених.- 2005.-вип.7.-С.123.
10. Стецюк Т.М., Дікал М.В.,Висоцька В.Г., Магаляс В.М. Пошкодження проксимального відділу нефрону при гломерулонефриті Ліндемана-Мазугі // Міжнародна студентська наукова конференція “Молодь - медицині майбутнього”.2005.- Одеса.- С.63-64. (Дисертант самостійно провів експериментальні дослідження та здійснив статистичну обробку отриманих даних).
АНОТАЦІЯ
Дікал М.В. Механізми розвитку тубуло-інтерстиційного синдрому при хронічному нефриті Мазугі (експериментальне дослідження).-Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.04.- патологічна фізіологія.- Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця МОЗ України, Київ, 2008.
Дисертацію присвячено вирішенню наукової задачі щодо патогенезу тубуло-інтерстиційного синдрому як основи розвитку хронічного та швидко-прогресуючого патологічного процесу в кірковій, мозковій речовині та сосочку нирок за умов хронічного нефриту Мазугі.
Доведено, що активація сукцинатдегідрогенази в дистальному відділі нефрону за хронічного нефриту Мазугі супроводжувалася адекватною тенденцію до зростання транспорту іонів натрію в цьому відділі ниркових канальців. За умов формування тубуло-інтерстиційного синдрому біохімічно обгрунтовано розвиток вторинної деструкції сполучної тканини, що підтверджено зростанням вільного оксипроліну в сечі, мозаїчністю змін тканинного протеолізу, фібринолізу, пероксидного окиснення ліпідів, антиоксидантного захисту та окиснювальної модифікації білків. Хронічний гломерулонефрит Мазугі супроводжується зростанням концентрації фактора некрозу пухлин-альфа в плазмі крові та супроводжується атрофією канальців нефрону, що пояснюється активацією процесів апоптозу за участю даного фактора. Встановлено захисний вплив урокінази та препарату GA-40 на розвиток тубуло-інтерстиційного синдрому за хронічного нефриту Мазугі
Ключові слова: тубуло-інтерстиційний синдром, хронічний нефрит Мазугі, препарат GA-40, урокіназа.
АННОТАЦИЯ
Дикал М.В. Механизмы развития тубуло-интерстиционного синдро-ма при хроническом нефрите Масуги (экспериментальное исследование).- Рукопись.
Дисертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.04.- патологическая физиология.- Институт физиологии им.А.А.Богомольца МОЗ Украины, Киев, 2008.
Дисертация посвящена решению научной задачи в отношении патогенеза тубуло-интерстиционного синдрома как основу развития хронического и быстропрогресирующего патологического процесса в корковом, мозговом веществе и сосочке почек при наличии хронического нефрита Масуги, а также патогенетическим обоснованием лечения даного патологического процеса.
Доказано, что активация сукцинатдегидрогеназы в дистальном отделе нефрона при хроническом нефрите Масуги сопровождалась адекватной тенденцией к увеличению транспорта ионов натрия в этом отделе почечных канальцев. При условиях формирования тубуло-интерстиционного синдрома биохимически обосновано развитие вторичной деструкции соединительной ткани, что подтверждено увеличением свободного оксипролина в мочи, мозаичностью изменений тканевого протеолиза, фибринолиза, пероксидного окисления липидов, антиоксидантной защиты и окислительной модификации белков. Хронический гломерулонефрит Масуги сопровождается увеличением концентрации фактора некроза опухолей-альфа в плазме крови и сопровождается атрофией канальцев нефрона, что обьясняется активацией процессов апоптоза при участии данного фактора.
При морфологическом исследование при хроническом нефрите Масуги установлено наличие тубуло-интерстиционного синдрома в корковом, мозговом веществе и сосочке почек, что подтверджено атрофическими и дистрофическими изменениями канальцев нефрона, наличием патологичеаких изменений со стороны базальных мембран, интерстиция, инфильтрации стромы клеточными елементами, с наличием тромбоза и фиброза. Впервые показано наличие фиброзной трансформации интерстиционных клеток ІІ типа сосочка почек.
Установлено защитное влияние урокиназы и препарата GA-40 на развитие тубуло-интерстиционного синдрома при хроническом нефрите Масуги.
Впершые установлено защитное влияние урокиназы на розвитие тубуло-интерстиционного синдрома при хроническом нефрите Масуги, что проявляется усилением протеолиза, фибринолиза плазмы крови, увеличением проксимальной и дистальной реабсорбции ионов натрия, снижением величины протеинурии, снижением степени интерсти-ционного фиброза, улучшением кислотовыдилительных процесов в канальцах нефрона.
Впервые показано, что препарат GA-40 в условиях розвития тубуло-интерстиционного синдрома при хроническом нефрите Масуги проявляет защитное влияние на сбалансированность регуляторных процесов в корковом веществе и сосочке почек, что проявляется в предупреждение разрастания соединительной ткани в интерстиции почек, предупреждает процесы обтурации на уровне почечного сосочка и тормозит розвитие гломерулосклероза.
Ключевые слова: тубуло-интерстиционый синдром, хронический нефрит Масуги, препарат GA-40, урокиназа.
SUMMARY
Dical M.V. Mechanisms of the development of tubulo-interstitial syndrome in chronic Masugi nephritis (an experimental study).- Manuscript.
The thesis for obtaining the academic degree of a Candidate of Medical Sciences 14.03.04 - Pathologic Physiology.- Bogomolets’ O.O. Institute of Physiology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2008.
The dissertation deals with the solution of the scientific task pertaining to the pathogenesis of the tubulo-interstitial syndrome as the basis of the development of a chronic and rapidly progressing pathological process in the cortical, medullary sub>stance and the renal papilla under the conditions of chronic Masugi nephritis.
It has been proved that an activation of succinate dehydrogenase in the distal portion of the nephron and chronic Masugi nephritis was accompanied by and adequate tendency towards an increase of the transport of sodium ions in this portion of the renal tubules. Under the conditions of forming the tubulo-interstitial syndrome the development of secondary destruction of the connective tissue has been biochemically sub>stantiated and that has been corroborated by an increase of free urinary oxyproline, mosaicism of changes of tissue protheolisis, fibrinolysis, lipid peroxidation, antioxidant protection and oxidative protein modification. Chronic Masugi glomerulonephritis is accompanied with an elevation of the blood plasma consentration of the alpha-tumour necrosis factor and with atrophy of the nephron tubules that is accounted for by an activation of the processes of apoptosis with the participation of the factor gnestion. A protective influence of urocinase and the GA-40 preparation on the development of the tubulo-interstitial syndrome in the presence of chronic Masugi has been established.
Key words: tubulo-interstitial syndrome, chronic Masugi nephritis, GA-40 preparation, urocinase.
Надруковано у ВІЦ "Місто".
58022 м. Чернівці, вул. Головна, 173 а
Формат 60х84/16.
Обл. вид. арк. 1,1. Ум. друк. арк. 1,16
Тираж 100 пр.