Бактериальная система секреции белков первого типа

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Биологический факультет

Кафедра молекулярной биологии

БАКТЕРИАЛЬНАЯ СИСТЕМА СЕКРЕЦИИ БЕЛКОВ

ПЕРВОГО ТИПА

Курсовая работа

студента 3 курса

Войцицкого А. М.

Научный руководитель:

к.х.н., преподаватель Русь О. Б.

Минск 2004

Содержание

Введение 5

Краткая характеристика бактериальных систем секреции 6

Строение системы секреции первого типа 8

ABC-транспортеры 14

Организация генов, кодирующих компоненты системы секреции первого типа 16

Сигнальные последовательности субстратов 18

Заключение 20

Список литературы 21

Список сокращений

АТФ-связывающая кассета (ATP-binding cassette) - ABC

Белок, связывающий мембраны (Membrane fusion protein) - MFP

Белок внешней мембраны (Outer membrane protein) - OMP

Ядерный магнитный резонанс - ЯМР

Введение

Процесс секреции белков является важным аспектом жизнедеятельности бактерий, поскольку значительное количество белков бактериальной клетки локализованы вне цитоплазмы. Способность к секреции белков является важнейшей для вирулентных бактерий, поскольку в процессе инфекции многие белковые продукты должны располагаться на внешней поверхности бактериальной клетки, либо секретироваться во внешнюю среду. Кроме того, секреция белков имеет важнейшее значение для биотехнологии, поскольку очистка белков из культуральной среды простого состава значительно проще, чем из лизатов, которые представляют собой сложные смеси различных веществ. В связи с этим изучение процесса белковой секреции является весьма актуальной проблемой. Результатом проведенных ранее исследований стало обнаружение нескольких путей экспорта белка. Впоследствии они были разделены на группы, внутри которых процесс секреции идентичен или очень схож. Сейчас выделяют пять основных типов секреции белков. Одним из них является система секреции первого типа. Посредством этой системы бактериальные клетки экспортируют широкий круг различных субстратов, включающий в себя ферменты, токсины, полисахариды, антибиотики и др. соединения. Несмотря на относительную простоту устройства этого аппарата секреции, остается еще достаточное количество невыясненных вопросов в этой области. Недостаточная изученность строения и функционирования этой системы секреции, а также неоспоримая важность секретируемых ею белков являются причиной, по которой изучение этой темы является весьма актуальным.

Целью данной работы является сбор и обобщение имеющейся на этот день информации о бактериальной системе секреции первого типа.

Краткая характеристика бактериальных систем секреции

Для секреции белков бактериальные клетки используют различные системы секреции в зависимости от строения и конечной локализации белка. Поэтому является необходимым приведение небольшого обзора систем секреции всех типов.

Секреция первого типа. Аппарат этой системы секреции устроен относительно просто. Он включает в себя три компонента белковой природы. Эта система является Sec-независимой и осуществляет секрецию субстратов непосредственно из цитоплазмы в одну стадию без периплазматических посредников. По этому пути секретируются токсины, протеазы, липазы, антибиотики и другие соединения (D. Thanassi et al., 2000).

Секреция второго типа. Эта система секреции устроена уже довольно сложно. Характерной особенностью является ее разделение на две части и секреция субстратов в две стадии. Первая часть, называемая Sec-системой, экспортирует белки через цитоплазматическую мембрану, далее белки либо остаются в периплазме, либо секретируются через внешнюю мембрану посредством терминальных компонентов системы секреции (S. Lory, 1998). По этому пути секретируются такие белки, как пектатлиазы, пектинметилэстеразы и целлюлазы рода Erwinia, целлюлаза, протеаза и амилаза Xanthomonas campestris, липаза, фосфолипаза, эластаза, энтеротоксин А у Pseudomonas aeruginosa, амилаза и протеаза Aeromonas hydrophila, хитиназа, протеаза и холерный токсин Vibrio cholerae (J. Hacker at al., 2000). В связи с большим количеством и разнообразием субстратов, секретируемых через этот аппарат секреции, его называют “общим секреторным путем” (General Secretory Pathway, GSP).

Секреция третьего типа. Этот тип секреции, подобно первому типу, является независимым от Sec-системы. Характерной особенностью его является доставка субстратов (факторов вирулентности) непосредственно в клетку эукариотического хозяина, также наличие большого количества секреторных шаперонов. Сам аппарат включает в себя около двадцати белковых компонентов, большая часть которых расположена во внутренней мембране, и по структуре довольно схож с системой сборки жгутика. Посредством системы секреции третьего типа экспортируются многие факторы вирулентности патогенов человека и животных, а также Avr-белки, харпины и другие факторы вирулентности фитопатогенных бактерий (J. Hacker еt al., 2000).

Секреция четвертого типа. Аппарат секреции четвертого типа состоит из двух компонентов: конъюгационного канала, через который происходит транслокация субстратов, и конъюгационного пилюса, необходимого для контакта с реципиентной клеткой. Строение этой системы секреции сходно со строением аппарата конъюгации некоторых плазмид. Она также обладает широкой специфичностью как субстратов (экспортируются крупные нуклеопротеидные комплексы, сложные белковые токсины, мономерные белки), так и реципиентов, т.к. ими могут служить практически все живые организмы (S. Lory, 1998).

Секреция пятого типа. В некоторых публикациях именуется системой секреции четвертого типа. Эта система секреции включает в себя группу белков, называемых автотранспортерами, к числу которых относятся: протеазы (IgA) Neiseria gonorrhoeae, цитотоксин (Vac) Helicobacter pylori. Автотранспортеры экспортируются из цитоплазмы через Sec-систему с отщеплением сигнальной аминоконцевой последовательности. Некоторые из них могут оставаться заякоренными в клеточной стенке, другие же экспортируются непосредственно во внеклеточное пространство (J. Hacker еt al., 2000).

Строение системы секреции первого типа

В сравнении с другими системами секреции аппарат секреции первого типа устроен относительно просто. Во всех случаях он состоит из трех компонентов белковой природы. Первый принадлежит к классу АТФаз, называемых ABC-транспортерами и обеспечивает энергозависимые стадии процесса транспорта. Этот белок является заякоренным во внутренней мембране и ассоциированным со вторым белком MFP, обеспечивающим слияние цитоплазматической и наружной мембраны, и фактически образующим канал, через который транспортируется секретируемый белок. Третий белок OMP, так называемый белок-щвейцар (gatekeeper), локализован во внешней мембране. Его функцией является создание секреторного мембранного канала и его закрытие в отсутствие субстрата (D. Thanassi еt al., 2000).

Рис. 1. Строение системы секреции I типа.

(по D. Thanassi еt al., 2000)

Первый тип секреции используется широким кругом грамотрицательных бактерий для экспорта токсинов, протеаз, липаз. Кроме того, эта система сохраняется при переходе от прокариот к эукариотам и экспортирует большое число токсинов и антибиотиков. Система секреции первого типа является Sec-независимой и экспортирует белки в один этап непосредственно из цитоплазмы во внешнюю среду через внешнюю мембрану без периплазматических посредников. Субстраты этой системы секреции лишены сигнальных амино-концевых последовательностей, сигнал к секреции у них расположен на карбокси-конце в пределах последних 60 аминокислотных остатков (D. Thanassi еt al., 2000).

Система секреции α-гемолизина Escherichia сoli представляет собой прототип системы секреции первого типа, и на сегодняшний день хорошо изучена. Она состоит из трех компонентов: TolC, HlyD, HlyB. Белок TolC является аналогом OMP для экспорта α-гемолизина, и представляет собой тримерный комплекс, расположенный во внешней мембране. Предполагается, что он состоит из пориноподобного β-складчатого мембранного домена с гидрофильной карбокси-концевой областью, расположенной в периплазматическом пространстве. Однако, недавний анализ последовательности указывает на то, что TolC и другие OMP не являются поринами. OMP функционирует как канал секреции через внешнюю мембрану, что было доказано порообразующим действием олигомеров TolC в экспериментальных липидных бислоях (D. Thanassi еt al., 2000). Периплазматический MFP (HlyD) также является тримерным и взаимодействует и с OMP, и с ABC-транспортером (HlyB). HlyD содержит короткий гидрофильный амино-концевой домен, заякоренный во внутренней мембране, включающий около 150 аминокислотных остатков; крупный гидрофобный домен, расположенный в периплазме, включающий 275 аминокислотных остатков, и карбокси-концевой домен, имеющий β-складчатую структуру, способный связываться с внешней мембраной, содержащий 275 аминокислотных остатков (M. J. Fath еt al., 1993). Предполагается, что MFP облегчает секрецию субстрата без промежуточного периплазматического звена, формируя закрытый канал, соединяющий внутреннюю и внешнюю мембраны, и осуществляя прямой контакт между ABC-транспортером и OMP. Что касается HlyB, то его точное строение пока не установлено, предполагается, что он состоит из восьми доменов. Два из них в амино-концевой области и шесть в центральной гидрофобной области. Результаты экспериментального изучения этого аппарата привели к возникновению двух моделей секреции первого типа (D. Thanassi еt al., 2000).

Эксперименты по секреции α-гемолизина E. coli показывают, что ABC-транспортер и MFP ассоциируются еще до связывания с субстратом. Прикрепление субстрата к этому комплексу вызывает контакт MFP с OMP. Это соединение является обратимым, и разрушается сразу после экспорта субстрата. Энергия гидролиза АТФ посредством ABC-транспортера расходуется только на транслокацию субстрата и не требуется для связывания субстрата или для сборки комплекса (D. Thanassi еt al., 2000).

Эксперименты по секреции гемопротеина Serratia мarcescens и металлопротеазы Erwinia chrysanthemi указывают на немного иной порядок событий. По этой модели, ABC-транспортер и MFP не связываются перед закреплением субстрата. Субстрат в первую очередь связывается с ABC-транспортером, затем образовавшийся комплекс ассоциируется с MFP, и только потом происходит связывание с OMP, после чего происходит секреция субстрата. Для определения правильной модели, или для уточнения возможных индивидуальных отличий в функционировании аппарата секреции первого типа необходимы дальнейшие исследования (D. Thanassi еt al., 2000).

Было установлено, что ОМР системы секреции α-гемолизина (TolC), используется также в системе секреции колицина V и в некоторых других системах, например при сегрегации хромосом, а также он может формировать канал во внешней мембране, специфический для медикаментов. ОМР системы секреции гемопротеина S. marcescens, называемый HasF, является в высокой мере идентичным с TolC E. сoli. Для воссоздания секреции HasА у E. сoli необходимо наличие в качестве ОМР либо TolC, либо HasF, либо PrtF. Такие гибридные секреторные системы функционируют как для секреции HasA, так и для секреции протеазы. Это является типичным примером комплементации ОМР (R. Binet et al., 1997). В частности, степень гомологии между компонентами системы секреции липазы S. marcescens, белками lipB, lipC, lipD и компонентами транспортера металлопротеазы Er. chrysanthemi PrtD, PrtE, PrtF составляет 45-55%. А гомология между LipB и LipC, и HasD, и HasE у S. marcescens составляет 45-53%. Эти показатели считаются довольно высокими (H. Akatsuka et al., 1998). Однако было выявлено, что не все комбинации между компонентами гибридных секреторных систем являются активными. Так, HasE формирует активные экспортеры и с PrtF, и с TolC, тогда как PrtE может формировать активный экспортер только с PrtF, но не с TolC. Исследования этих мультибелковых комплексов in vitro подтвердили существование некоторых функциональных различий между HasE и PrtE. Полученные результаты могут быть полезными при определении сайтов, ответственных за связывание MFP и OMP (H. Akatsuka et aj., 1998).

С другой стороны, исследования in vivo и in vitro показывают, что HasD и PrtD могут образовывать активные секреторные системы с PrtE и HasE в любых комбинациях (H. Akatsuka et al., 1998).

Также были проведены исследования по изучению секреции липазы LipA S. marcescens посредством систем LipB-LipC-LipD и HasD-HasE-HasF. В результате опытов было выяснено, что HasD-HasE-HasF-транспортер осуществляет секрецию LipA так же эффективно, как и LipB-LipC-LipD. LipB-HasE-HasF-система могла производить секрецию LipA, но не была способна секретировать HasA, система HasD-Lip-CLipD не была способна к секреции обоих субстратов (H. Akatsuka et al., 1998).

В случае экспериментов с системами секреции липазы LipA S. marcescens и металлопротеазы PrtC E. chrysanthemi были получены сходные результаты, приведенные в таблице:

Таблица 1

Эффективность гибридных систем секреции (по H. Akatsuka et al., 1998).

Не все комбинации компонентов привели к формированию эффективных систем секреции. Полученные результаты позволили сделать некоторые конкретные выводы. В частности, что PrtD-PrtE-LipD-система не способна экспортировать ни LipA, ни PrtC, в то время как, LipB-LipC-PrtF-система оказалась настолько же функциональной для LipA секреции в E. coli как и в S. marcescens. PrtE может взаимодействовать только с PrtF, тогда как HasE и LipC показывают более широкие возможности связывания с различными белками. Было также установлено, что PrtD не может ассоциироваться с LipC, а LipB-PrtE-PrtF-система является очень неэффективной в отношении экспорта LipA и PrtС (H. Akatsuka et al., 1998).

В ходе исследований было установлено влияние шаперона SecB на процесс секреции HasA у S. marcescens. Точное его значение на данный момент не установлено, но было показано, что инактивация этого шаперона приводит к блокированию секреции HasA (P. Delepelaire et al., 1998).

К настоящему времени установлено строение систем секреции первого типа у многих микроорганизмов, некоторые из них приведены в таблице 2. Однако остается довольно большое количество секреторных систем неполного состава, для которых остаются невыясненными либо некоторые компоненты, либо субстраты (M. J. Fath еt al., 1993).

Таблица2

Некоторые системы секреции первого типа (по M. J. Fath еt al., 1993).

ABC-транспортеры

Семейство АВС–транспортеров включает в себя специфические АТФ-связывающие белки-транслокаторы. В 1993 году M. J. Fath (M. Fath еt al., 1993) предложил классифицировать их на три группы: эукариотические АВС-транспортеры, бактериальные АВС-ипортеры и бактериальные АВС-экспортеры, на рис.2 представлено строение некоторых из них. Характерно, что ABC-белки являются консервативными и осуществляют трансмембранный перенос большого количества субстратов как в прокариотических, так и в эукариотических клетках. Они наиболее часто состоят из двух закрепленных в мембране гидрофобных и двух консервативных гидрофильных АТФ-связывающих доменов. Эти домены могут быть как частями одного полипептида, так и нескольких отдельных полипептидов. В опытах in vitro было показано, что в ряде случаев этих четырех доменов одного или нескольких полипептидов оказывается достаточно для осуществления трансмембранного перемещения растворов. И все же большинство бактериальных ABC-транспортных систем включает в себя различные дополнительные белки. Этими дополнительными белками являются MFP и OMP (R. Binet et al., 1997).

АВС-импортеры имеют строение, сходное со всеми остальными представителями транспортных АТФ-аз. Но при образовании транспортной системы они присоединяют иные компоненты. В системах, осуществляющих импорт, отсутствуют характерные для системы первого типа OMP и MFP. Вместо них присутствует особый периплазматический белок, который связывается с импортируемым субстратом и предоставляет его АТФ-азе для непосредственного переноса (M. Fath еt al., 1993).

Помимо АВС-экспортеров, осуществляющих транспорт белков, в бактериальных клетках существует обширная группа АВС-экспортеров, выполняющих транспорт небелковых субстратов, например, полисахаридов и ионов. Характерной особенностью этих переносчиков является то, что они сами образуют активную транспортную систему и не требуют никаких дополнительных белков. Транспорт в этом случае осуществляется не во внеклеточное пространство, а в периплазму (M. Saier, 2000).

Подобные АВС-транспортеры обнаружены как в клетках грамположительных и грамотрицательных бактерий, так и в эукариотических клетках (M. Fath еt al., 1993).

Рис. 2. Строение АВС-транспортеров (по M. Fath еt al., 1993).

Организация генов, кодирующих компоненты системы секреции первого типа

Как правило, гены, кодирующие все три компонента системы, организованы в один оперон, обычно вместе с генами, кодирующими секретируемый белок. К примеру, гены, кодирующие четыре сходных по строению металлопротеазы E. chrysanthemi: PrtA (50кДа), PrtB (53 кДа), PrtC (55 кДа), PrtG (58 кДа) организованы в один оперон с генами, кодирующими все три компонента системы их секреции: PrtD (ABC-транспортер), PrtE (MFP), PrtF (OMP). В случае с E. coli, ген hlyA, кодирующий α-гемолизин, объединен с генами hlyB и hlyD, кодирующими соответственно ABC-транспортер и MFP. Так же дело обстоит и у S. marcescens. Ген hasA, кодирующий внеклеточный гемопротеин, организован в один оперон с генами hsaD (ABC-транспортер) и hasE (MFP). В этих двух случаях ген, кодирующий OMP, в единый оперон не включается и содержится отдельно. Кроме того, у S. marcescens обнаружен оперон, содержащий только гены, которые детерминируют компоненты системы секреции и ни одного гена, ответственного за синтез экспортных белков. Он содержит три гена: lipB (ABC-транспортер), lipC (MFP), lipD (OMP) (H. Akatsuka et al., 1998). Был выявлен также ряд оперонов, которые содержат гены, не относящиеся ни к системе секреции, ни являющиеся генами секретируемых белков. Эти гены кодируют белки, которые тем или иным образом выполняют регуляторную функцию (M. Fath еt al., 1993).

Организация Hly-оперона и некоторых других оперонов представлена на рис. 3. Ген hlyA кодирует 1023 аминокислоты α-гемолизина (HlyA), hlyB кодирует 707 аминокислот ABC-транспортера (HlyB), hlyD кодирует 477 аминокислот MFP (HlyD), и hlyC кодирует 170 аминокислот белка, который не имеет секреторной функции, но облегчает активацию HlyA. Ген tolC, кодирующий 495 аминокислот OMP (TolC) в этот оперон не включается и содержится отдельно.

На данный момент выявлены и расшифрованы опероны систем секреции первого типа многих микроорганизмов (M. Fath еt al., 1993).

Рис. 3. Оперонная организация генов, кодирующих компоненты системы секреции I типа некоторых бактерий. Сверху вниз: система секреции α-гемолизина E. coli, протеаз E. chrysanthemi, колицина V E. coli, субтилина B. sub>tilis, капсулярного полисахарида E. coli (по M. Fath еt al., 1993).

Сигнальные последовательности субстратов

Субстраты, секретируемые посредством системы секреции первого типа, не имеют сигнальных амино-концевых последовательностей. Вместо них имеются карбокси-концевые секреторные сигналы, расположенные в пределах последних 60 аминокислотных остатков, впервые обнаруженные на α-гемолизине. В экспериментах с протеазой PrtG E. chrysanthemi было установлено, что наименьшая карбокси-концевая последовательность, позволяющая начать эффективную секрецию, содержит последние 29 аминокислот PrtG, кроме того, низкая, но все же существенная секреция может быть индуцирована последними 15 аминокислотами PrtG (R. Binet et al., 1997). Кроме того, было показано, что карбокси-концевая сигнальная последовательность, состоящая из отрицательно заряженных аминокислотных остатков, является консервативной для гомологичных протеаз. Сравнение последовательностей показало, что протеазы и липазы тоже имеют весьма сходные карбокси-концевые последовательности. Однако важным является тот факт, что гомология последовательностей этих соединений является неполной. А вот секреторные сигналы протеаз и различного рода токсинов являются весьма различными и специфическими, кроме того, комплементация между компонентами систем секреции этих двух семейств белков является очень незначительной. Тем не менее, каждый сигнал может индуцировать секрецию чужеродного белка посредством своего специфического транспортера (R. Binet et al., 1997).

Изучение фрагмента карбокси-конца очищенной протеазы G посредством ЯМР показало, что он представляет собой стабильную α-спираль, расположенную перед 7 – 8 концевыми аминокислотными остатками.

При изучении процессов секреции белков была показана роль особой области, расположенной выше карбокси-концевой сигнальной последовательности на большинстве экспортируемых субстратов. Токсины, протеазы и липазы, секретируемые системой секреции первого типа, имеют такую область, состоящую из богатой глицином последовательности (GGXGXD), которая повторяется 4–36 раз, в зависимости от белка.

При сравнении процессов секреции различных белковых субстратов, содержащих такие последовательности, было установлено, что они играют важнейшую роль при секреции некоторых пептидов. Возможно, что богатые глицином повторы действуют как внутренние шапероны, способствуя лучшему разделению секреторного сигнала и остатка белка (R. Binet et al., 1997).

Заключение

Посредством системы секреции первого типа секретируется широкий круг субстратов, включающий в себя ряд ферментов, токсинов, антибиотиков, и других биологически активных соединений. Эта система секреции характерна как для прокариотических, так и для эукариотических клеток. Во всех случаях она состоит из трех компонентов белковой природы: ABC-транспортера, который является АТФ-азой, осуществляющей энергозависимые стадии транслокации; белка, формирующего периплазматический канал, соединяющий ABC-транспортер с третьим компонентом системы – белком-швейцаром, образующим секреторный канал во внешней мембране. Система секреции первого типа является Sec-независимой и осуществляет секрецию субстрата в одну стадию из цитоплазмы непосредственно во внеклеточное пространство без присутствия каких-либо периплазматических посредников. Сигналом к секреции по этому типу является последовательность из 60 аминокислотных остатков, находящаяся на карбокси-конце полипептида. Выявлены также гибридные системы секреции первого типа, состоящие из компонентов присущих разным системам этого типа. Несмотря на относительно простое устройство данной системы секреции в сравнении с другими аппаратами секреции, существует довольно большое количество неясных и спорных вопросов в этой области. В частности, недостаточно изучена последовательность событий в процессе секреции субстратов, а также видовая специфичность строения самой системы. В связи с этим и немаловажным значением секретируемых соединений, изучение этого вопроса является весьма актуальным и перспективным.

Список литературы

H. Akatsuka, R. Binet, E. Kawai, C. Wandersman, and K. Omori. Lipase secretion by bacterial hybrid ATP-Binding Cassette Exporters: molecular recognition of the LipBCD, PrtDEF, and HasDEF exporters. // Journal of bacteriology. - 1997. – Vol. 179. №15 - Р. 4754–4760.

R. Binet, S. Le´toffe, J. M. Ghigo, P. Delepelaire, C. Wandersman. Protein secretion by Gram-negative bacterial ABC exporters – a review. // Gene. - 1997. – Vol. 192. - Р. 7–11.

W. H. Bingle, J. F. Nomellini, and J. Smit. Secretion of the Caulobacter crescentus S-Layer potein: further localization of the C-terminal secretion signal and its use for secretion of recombinant proteins. // Journal of bacteriology. - 2000. – Vol. 182. №11. - Р. 3298–3301.

P. Delepelaire, C. Wandersman. The SecB chaperone is involved in the secretion of the Serratia marcescens HasA protein through an ABC transporter. // EMBO J. - 1998. - Vol. 17. №4. - P. 936–944.

M. J. Fath, R. Kolter. ABC Transporters: Bacterial Exporters. // Microbiological reviews. -1993. – Vol. 57. №4. - Р. 995–1017.

J. Hacker, J. B. Kaper. Pathogenicty islands and the evolution of microbes. // Annu. Rev. Microbiol. - 2000. – Vol. 54. - Р. 641–79.

C. J. Hueck. Type III Protein Secretion Systems in Bacterial Pathogens of Animals and Plants. // Microbiology and molecular biology reviews. - 1998. – Vol. 62. №2. - Р. 379–433.

S. Letoffe and C. Wandersman. Secretion of CyaA-PrtB and HlyA-PrtB Fusion Proteins in Escherichia coli: Involvement of the Glycine-rich repeat domain of Erwinia chrysanthemi protease B. // Journal of bacteriology. - 1992. – Vol. 174. №15 - Р. 4920–4927.

S. Lory. Secretion of proteins and assembly of bacterial surface organelles: shared pathways of extracellular protein targeting. // Current Opinion in Microbiology. - 1998. – Vol. 1. - Р. 27–35.

L. M. Moreira, J. D. Becker, A. P. and A. Becker. The Sinorhizobium meliloti ExpE1 protein secreted by a type I secretion system involving ExpD1 and ExpD2 is required for biosynthesis or secretion of the exopolysaccharide galactoglucan. // Microbiology. - 2000. – Vol. 146. - Р. 2237–2248.

M. H. Saier. Families of transmembrane sugar transport proteins. // Molecular Microbiology. - 2000. - Vol. 35. №4. - P. 699–710.

D. G. Thanassi, S. J Hultgren. Multiple pathways allow protein secretion across the bacterial outer membrane. // Current Opinion in Cell Biology. - 2000. - Vol. 12. - Р. 420–430.