Трансгенные растения как биопродуценты белков медицинского назначения

Трансгенные растения как биопродуценты белков медицинского назначения

Успехи в области генетической инженерии растений открыли новые возможности для получения рекомбинантных белков. Для этой цели широко используются клетки бактерий, дрожжей, млекопитающих и насекомых. Однако такие системы имеют ряд существенных недостатков. В клетках прокариот не происходят посттрансля-ционная модификация и правильная укладка (фолдинг) полипептидных цепей многих эукариотических белков. Клетки дрожжей, млекопитающих и насекомых лишены подобных недостатков, но их использование в качестве биопродуцентов ограничено высокой себестоимостью выхода рекомбинантных белков (Russel, Clarke, 1999).

По сравнению с вышеупомянутыми системами экспрессии растения имеют ряд особенностей и преиму-ществ. Прежде всего необходимо отметить, что в клетках высших растений происходят гликозилирование и фолдинг белков, сходные с таковым в клетках млекопитающих. Культивирование растений не требует доро-гостоящего оборудования, а сельскохозяйственные масштабы продукции гарантируют доступность реком-бинантного препарата в количествах, достаточных для клинических испытаний и широкого терапевтического использования. В отличие от животных, растительные клетки не содержат в своём составе патогенные для человека вирусы, а также прионы и, таким образом, могут служить безопасным источником рекомбинантных белков медицинского назначения. Хотя стоимость выделения и очистки целевого белка из растений-продуцентов может быть сопоставима с таковой для других систем, наработка сырого материала обходится значительно дешевле. В ряде случаев, например, при использовании трансгенных растений в качестве "съедобных вакцин" выделение белка в чистом виде не требуется. В дополнение ко всему перенос фраг-ментов экзогенной ДНК в растительный геном и регенерация у растений происходят значительно проще по сравнению с животными (Daniell et al., 2001).

Известно, что аппарат транскрипции и трансляции у растений является универсальным и может быть адап-тирован не только для накопления гомологичных белков, не синтезируемых данным видом растения, но и для синтеза гетерологичных белков как бактериального, так и животного происхождения. С другой стороны, сами растения in vivo могут служить благоприятной средой для развития различных организмов - бактерий и вирусов, геном которых может быть модифицирован и адаптирован для синтеза соответствующих гетерологич-ных белков. Анализируя данные литературы, необходимо отметить, что поиск различных систем для экспрессии чужеродных генов за последние десять лет был связан с развитием трёх основных подходов.

Первым из них был предложен путь использования трансгенных растений, в ядерный геном которых перене-сены гены, контролирующие синтез соответствующих гетерологичных белков (De la Riva, 1998). Получение таких растений было основано на природной способности почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens переносить часть своей собственной ДНК в виде Т-области мегаплазмиды в растительные клетки. Именно эта часть Ti-плазмиды была использована учёными для переноса генно-инженерных конструкций, включающих различные целевые гены. В качестве целевых можно было использовать и гены гетерологичных белков меди-цинского назначения. Необходимо отметить, что использование только агробактериального переноса в значи-тельной степени сужало круг растений-реципиентов и ограничивало его, как правило, до двудольных. Поэтому дальнейшее развитие идеи использования растительного генома для синтеза гетерологичных белков стимули-ровало поиск новых способов переноса фрагментов экзогенной ДНК в геном растений. Были разработаны мето-ды прямой доставки чужеродных генов в растительный геном, такие, как микроинъекции (Neuhaus et al. , 1987), электропорация (Fromm et al. , 1985) и методы биобаллистики (Klein et al. , 1987). В этом слу-чае для переноса использовалась очищенная плазмидная ДНК, в которой содержались генетические конструк-ции с целевыми генами.

При переносе в геном растения чужеродные гены, как правило, стабильно интегрируются и передаются по-томкам в последующих поколениях согласно законам Менделя (Horsch et al., 1984; Budar et al. , 1986; De-roles, Gardner, 1988; Heberle-Bors et al. , 1988).

Хотя идея внедрения экзогенной ДНК в растительный геном для наработки соответствующих продуктов в растении представляется весьма перспективной, этот подход не лишен и некоторых недостатков. Среди них не-обходимо отметить низкий уровень экспрессии перенесенных генов, даже при использовании очень сильных промоторов. Содержание сывороточного альбумина человека в трансгенных тканях табака составило 0,02 % от суммарного белка (Sijmons et al. , 1990). Ещё меньшие значения были получены для эритропоэтина (0,003 %) и -интерферона (0,001 %) (Edelbaum, 1992; Kusnadi et al. , 1997). Одной из причин этого, по-видимому, является увеличение скорости деградации мРНК чужеродно-го гена, когда её уровень достигает порогового значения. Этот механизм, возможно, служит одним из способов защиты растения от РНК-содержащих вирусов (Matzke et al. , 1994; Matzke M., Matzke A., 1995; Vaucheret, 2001). Второй причиной низкого уровня продукции является протеолиз чужеродных белков в цитоплазме расти-тельной клетки. Введение в полипептидную цепь целевого белка сигнальных последовательностей, направляю-щих его накопление в эндоплазматической сети или секрецию в апопласт, где частота протеолиза значительно ниже, позволяет достичь повышения продуктивности трансгенных растений в 100 раз (Giddings et al. , 2000; Menassa et al. , 2001). Экспрессия целевых белков в запасной ткани семян, где уровень биодеградации ниже, чем в обводнённых тканях (листья, плоды), способствует повышению продуктивности на 2-3 порядка. Так, содер-жание химерного энкефалина человека в семенах трансгенного A. thaliana составило 2,9 % от суммарного белка. Этого удалось достичь введением в полипептидную цепь энкефалина сигнальной последовательности глю-телина (запасного белка риса), направляющей его транспортировку в компартменты накопления запасных белков. Химерный ген находился под контролем промотора гена глютелина, который направлял его тканеспецифичную транскрипцию в клетках запасной ткани семян (Vandekerckhove et al. , 1989).

Интеграция чужеродных генов в ядерный геном растения сопряжена и с рядом проблем биобезопасности использования генетически модифицированных организмов. При получении трансгенных растений в сель-скохозяйственных масштабах существует опасность утечки трансгена в окружающую среду (выход из-под контроля) в результате переопыления с близкородственными дикорастущими видами. Для повышения уров-ня биобезопасности рядом исследователей было предложено использовать для трансгенеза стерильные по мужской линии растения (Menassa et al. , 2001).

Другой проблемой, возникающей при интеграции гетерологичных генов в ядерный геном растений, явля-ется вероятность "замолкания" трансгенов в последующих поколениях (сайленсинг). Вероятность сайлен-синга резко возрастает при встраивании множества копий чужеродного гена на геном растения (Finnegan, McElroy, 1994; Matzke et al. , 1994; Matzke М., Matzke А., 1995). Поэтому при создании трансгенных растений-биопродуцентов рекомбинантных белков среди трансформантов отбирают растения, содержащие только одну встройку чужеродного гена.

В связи с вышеперечисленными проблемами, возникающими при интеграции трансгенов в ядерный ге-ном, весьма привлекательным представляется способ переноса экзогенной ДНК в геном хлоропластов. Хлоропласты - органеллы растительной клетки, содержащие зеленый пигмент хлорофилл, а также ряд дру-гих пигментов, принимающих участие в поглощении световой энергии и осуществлении фотохимических реак-ций. По форме и размерам хлоропласты высших растений достаточно однородны. Некоторая вариабельность наблюдается в отношении их числа в расчете на одну клетку, которое варьирует от нескольких десятков до сот-ни и более. Каждый отдельный хлоропласт окружен двойной мембраной и имеет сложную внутреннюю структу-ру. В одной растительной клетке в среднем содержится от 5 до 10 тыс. копий хлоропластной ДНК, за счёт чего уровень экспрессии чужеродных белков достигает значений, сравнимых с уровнем экспрессии в E. coli (до 40 % от суммарного белка клетки) (Staub et al. , 2000; De Cosa et al. , 2001). Однако в литературе встречаются только единичные работы по получению растений с генетически модифицированными хлоропла-стами. Это связано с чрезвычайной сложностью методов их трансформации и последующего отбора.

Третий путь использования растений для накопления белков гетерологичного происхождения основан на природной способности растительных вирусов проникать в клетки растений и колонизировать растительные тка-ни (Mushegian, Shepherd, 1995). На этой основе возникает реальная возможность модификации вирусного гено-ма и адаптации его не только в качестве вектора для доставки в растения соответствующих генетических конст-рукций, но и в качестве матриц для транзиентной экспрессии генов, кодирующих синтез белков, представляющих коммерческий интерес. Для заражения растительных тканей используются рекомбинантные (+)РНК-содержащие вирусы растений, несущие в составе своего генома транскрипт чужеродного гена (Mushegian, Shepherd, 1995). Скорость мультипликации вирусной РНК в растениях чрезвычайно высока, за счёт чего достигается высокая ко-пийность транскриптов чужеродных генов в цитоплазме заражённых клеток. Поэтому продуктивность вирусной системы экспрессии в среднем на 2 порядка выше по сравнению со стабильной трансформацией растений (Giddings et al. , 2000).

В настоящее время широко используются два вида вирусов для продукции чужеродных белков в растениях: ви-рус табачной мозаики (ВТМ) и вирус мозаики коровьего гороха (ВМКГ). Вектор на основе РНК ВТМ использовался для получения ингибитора репликации ВИЧ α-трихосантина в Nicotiana benthamiana (Kumagai et al. , 1993). Для этого целевую последовательность, кодирующую α -трихосантин, поместили под субгеномный промотор белка оболочки ВТМ. Спустя две недели после заражения рекомбинантный α -трихосантин накапливался в листьях N. Benthamianaв количестве 2 % от суммарного белка. На основе ВМКГ удалось получить химерные частицы этого вируса с экспонированными на поверхности антигенными детерминантами ВИЧ1 (gp41) (Porta et al. , 1996). Для этого последовательность эпитопа gp41 была "сшита" с геном белка оболочки ВМКГ. Такие частицы обладали высокой иммунногенностью и были способны нейтрализовать инфекционные свойства ВИЧ1 in vivo.

Сравнивая пути наработки гетерологичных белков в растительных тканях, необходимо отметить, что каждый из них имеет свои преимущества и недостатки. В трансгенных растениях перенесенные гены стабильно встраиваются в геном и сохраняются в последующих поколениях, тогда как при интеграции генов в геном вирусов в зараженных вирусами растениях обеспечивается их временная (транзиентная) экспрессия. Накопление соответствующих бел-ковых продуктов будет определяться периодом вегетации зараженного растения-хозяина. С другой стороны, пре-имуществом вирусного пути накопления белков в растениях является короткий период размножения вирусных час-тиц, простота инфицирования растений, а также широкий диапазон различных видов растений, которые могли бы быть использованы для этих целей.

Растения-продуценты антител

Цель иммунизации организма вакцинами - индуцировать продукцию антител на патогенный агент. Альтерна-тивой такому подходу является метод пассивной иммунизации, основанный на введении готовых иммуноглобу-линов. Широкое применение такого подхода долгое время было ограничено высокой стоимостью антител, полу-чаемых традиционными способами. В 1989 г. была показана возможность сборки функционально активных им-муноглобулинов класса IgG и IgA из лёгкой и тяжёлой цепей в растениях табака (Hiatt et al. , 1989). С того момента в нескольких крупных лабораториях мира были получены трансгенные растения-продуценты различных типов антител к эпитопам ряда патогенных агентов. В таблице 1 представлена сводка этих результатов.

Таблица 1

Растения-продуценты антител

Применение и специфичность	Класс антител	Растение-продуцент	Уровень продукции	Лит. ссылка
Зубной кариес; стрептококковый антиген	IgA-IgG	Табак	500 мкг/г сырого веса	Ma et al. 1995, 1998
Вирус простого герпеса 2	IgG	Соя	Нет данных	Zeitlin et al. 1998
Диагностика ряда заболеваний; антитела, специфичные к IgG человека	IgG	Люцерна	1 % суммарного белка	Khoudi et al. 1999
Терапия рака; раковый эмбриональный антиген	ScFv	Пшеница Рис	900 нг/г сырого веса (листья) 1,5 мкг/г сырого веса (семена) 29 мкг/г сырого веса (листья) 32 мкг/г сырого веса (семена)	Stoger et al. 2000; Torres et al. 1999

Как видно из таблицы 1, к настоящему времени получены трансгенные растения табака, люцерны, пшеницы, риса и сои. Среди этих растений выделяются две группы: продуценты иммуноглобулинов к антигенам двух пато-генных агентов (стрептококк и вирус простого герпеса второго типа) и антител, специфичных к раковому эмбрио-нальному антигену и к IgG человека.

Анализируя уровень экспрессии перенесённых генов в геноме растений-биопродуцентов антител, можно отме-тить, что уровень продуктивности иммуноглобулина к поверхностному антигену Staphylococcus mutants в растениях табака оказался наиболее высоким и составил 500 мкг/г сырого веса (табл. 1). Такие антитела, выделен-ные из трансгенных растений табака, предупреждали развитие кариеса у пациентов при непосредственном нане-сении их на зубную эмаль и не уступали по своим свойствам аналогичным антителам, получаемым из гибридомы мышей.

Иммуноглобулины к раковому эмбриональному антигену были получены в трансгенных растениях риса и пшеницы (табл. 1). Такие антитела используются в иммунотерапии онкологических заболеваний, а также для визуализации опухоли in vivo.

Трансгенные растения рассматриваются как потенциальный недорогой источник иммуноглобулинов для ме-дицинских и исследовательских целей. На рисунке представлена динамика стоимости одного грамма чистого IgA, производимого в разных экспрессирующих системах, по оценкам компании "Planet Biotechnology" (Daniell et al. , 2001). Из графика видно, что уровень экспрессии значительно влияет на конечную стоимость IgA в случае продукции в культуре клеток млекопитающих и молоке трансгенных животных. В меньшей степени зави-симость цены от уровня экспрессии наблюдается при использовании трансгенных растений. Это связано с тем, что конечная цена рекомбинантного белка складывается из стоимости наработки сырого материала и стоимости его выделения. Считается, что стоимость очистки приблизительно одинакова для всех систем, а различие обу-словлено затратами при наработке сырого материала, которая в клетках млекопитающих и трансгенных живот-ных гораздо выше.

Растения-продуценты субъединичных вакцин

Трансгенные растения-продуценты эпитопов болезнетворных агентов человека и животных получили название "съедобных вакцин". Механизм иммунизации такими вакцинами основан на антигенпредставляющей способности перитонеальных макрофагов тонкого кишечника млекопитающих. В кишечнике чужеродный белок, обладающий антигенными свойствами, распознается специальными М-клетками, которые широко представлены в толще слизи-стого эпителия. М-клетки транспортируют захваченный антиген к перитонеальным макрофагам и В-лимфоцитам, находящимся в лимфоидных образованиях тонкого кишечника (пейеровых бляшках). В результате презентации антигена на поверхности антиген-представляющих клеток происходит активация T-лимфоцитов-хэлперов, которые в сочетании с антигеном активируют В-лимфоциты. Дифференцированные В-клетки выходят из лимфоидных фолликулов слизистой оболочки и посту-пают через общую циркуляцию в мезентеральные лимфатические узлы, где происходит их созревание и превра-щение в плазматические клетки, синтезирующие специфические к антигену антитела. Плазматические клетки спо-собны снова мигрировать к слизистым оболочкам дыхательных путей, желудочно-кишечного и мочеполового трак-тов. Секреторные иммуноглобулины IgA транспортируются на поверхность слизистых оболочек, где они связыва-ются с чужеродными агентами и препятствуют их проникновению в организм. Следует отметить, что мукозная вак-цинация стимулирует как иммунный ответ слизистых оболо- чек - первого защитного барьера на пути патогенных агентов, так и общий иммунный ответ организма (Walmsley, Arntzen, 2000).

Рис. Динамика цены за 1 грамм рекомбинантного IgA, полученного из разных экспрессирующих систем в зависимости от уровня экспрессии. I - культура клеток млекопитающих; II - молоко трансгенной козы; III - трансгенные растения (семена); IV - трансгенные растения (зелёная биомасса) (По: Daniell et al., 2001).

Таблица 2

Антигены, экспрессированные в растениях

Патогенный агент или токсин	Растение-продуцент	Антиген	Ссылка
Вирус гепатита В	Табак Картофель Люпин Салат	HbsAg	Mason et al., 1992; Thanavala et al., 1995; Richter et al., 2000; Kapusta et al., 1999
Вирус бешенства	Томаты	Гликопротеин вируса бешенства	McGarvey et al., 1995
Энтеропатогенная E. Coli	Табак Картофель Кукуруза	В-субъединица энтеротоксина E. Coli	Haq et al., 1995; Masonet al., 1998; Streatfield et al., 2000
Холерный вибрион	Картофель	В-субъединица токсина V. Cholerae	Arakawa et al., 1997
Вирус ящура	A. thaliana Люцерна	VP1	Carrillo et al., 1998; Wigdorovitz et al., 1999
Streptococcus mutants (зубной кариес)	Табак	S. mutants поверхностный антиген SpaA	Tacket, Mason, 1999
Цитомегаловирус	Табак	Гликопротеин В	Tackaberry et al., 1999
Вирус Норфолк	Табак Картофель	Антиген капсида вируса Норфолк	Mason et al., 1996; Tacket et al., 2000
ВИЧ1	Табак	gp120	Giddings et al., 2000
Вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней	A. thaliana Табак Кукуруза	Гликопротеин S коронавируса	Tuboly et al., 2000; Streatfield et al., 2000

К настоящему времени получены трансгенные растения табака, картофеля, люпина, салата, томатов, кукуру-зы, A. thaliana и люцерны, синтезирующие антигены различных инфекционных патогенов человека и жи-вотных (табл. 2).

Первыми "съедобными вакцинами" были трансгенные растения табака и картофеля, экспрессирующие по-верхностный антиген вируса гепатита человека HbsAg (Mason et al., 1992). Скармливание клубней картофеля-продуцента HbsAg мышам стимулировало развитие мукозного (слизистого) и общего гуморального иммунного от-вета (Thanavala et al., 1995).

Токсины, выделяемые энтеропатогеннной E. Coli и холерным вибрионом, вызывают желудочно-кишечные расстройства у человека и животных и являются сильными оральными иммуногенами. При попадании в кишечник токсины вызывают продукцию специфических IgG и IgA иммуноглобулинов. Созданы трансгенные расте-ния табака, картофеля и кукурузы, синтезирующие В-субъединицу энтеротоксина E. Coli (табл. 2). Была про-анализирована степень протективности иммунитета, приобретенного мышами при оральной вакцинации трансген-ным картофелем. Иммунизированные мыши обладали устойчивостью к действию орально вводимого токсина по сравнению с контрольной группой, потреблявшей нетрансгенные клубни, хотя уровень устойчивости был ниже, чем у мышей, иммунизированных введением в желудок эквивалентного количества В-субъединицы природного токсина. Полученные на животных моделях результаты по выработке защитного иммунитета против энтеропатогенной E. coli были подтверждены в дальнейшем в клинических исследованиях на добровольцах (Tacket et al., 2000). В аналогичной работе (Arakawa et al., 1997) было показано развитие защитного иммунитета у мы-шей после скармливания клубней трансгенного картофеля, экспрессирующего В-субъединицу токсина V. cholerae. Иммунизация сопровождалась выработкой антител классов IgG и IgA.

Не останавливаясь подробно на других антигенах, приведённых в таблице 2, следует отметить, что практиче-ски во всех полученных растениях-продуцентах происходила сборка индивидуальных молекул антигена в мульти-мерные комплексы или вирусоподобные частицы, которые стимулировали развитие как мукозного, так и общего гуморального иммунного ответа при скармливании экспериментальным животным. Основные преимущества "съе-добных вакцин" - экономичность, безопасность и доступность для широкой иммунопрофилактики населения.

Таблица 3

Фармацевтические белки, полученные в трансгенных растениях

Применение	Растение-продуцент	Фармацевтический белок	Уровень продукции (в % от суммарного растворимого белка)	Ссылка
Анестезия	A. thaliana	Энкефалин	2,9 (семена)	Vandekerckhove et al., 1989
Цирроз печени, ожоги, хирургия	Табак	Сывороточный альбумин	0,02	Sijmons et al., 1990
Косметология	Табак	Гомодимер коллагена	0,01	Ruggiero et al., 1990
Лечение гепатитов С и В	Табак	-интерферон	0,001	Edelbaum, 1992
Заживление ран	Табак	Эпидермальный фактор роста	0,001	Higo, 1993
Ингибитор тромбина	Рапс	Гирудин	0,3 (семена)	Parmenter et al., 1995
Анемия	Табак	Эритропоэтин	0,003	Kusnadi et al., 1997
Заменитель крови	Табак	Гемоглобин , 	0,05 (семена)	Dieryck et al., 1997
Заменитель материнского молока	Картофель	Казеин	0,01	Chong et al., 1997
Фиброзный кистоз, кровотечения	Рис	-1-антитрипсин	Нет данных	Giddings et al., 2000
Антикоагулянт	Табак	Белок С	0,01	Cramer et al., 1999
Ингибитор трипсина	Кукуруза	Апротонин	Нет данных	Zhong et al., 1999
Гормон роста	Табак	Соматотропин	0,16 (семена)	Leite et al., 2000
Антимикробное средство	Картофель	Лактоферрин	0,1	Chong et al., 2000
Синдром Гоше	Табак	Глюкоцереброзидаза	1-10	Giddings et al., 2000
Воспалительные заболевания кишечника	Табак	Интерлейкин-10	0,0055	Menassa et al., 2001
Нейропения	Табак	ГМ-КСФ	0,03 (семена)	Sardana et al., 2002
Иммунотерапия рака	Картофель	Интерлейкин-2	0,06	Park, Cheong, 2002
Болезнь Педжета, остеопороз	Картофель	Kальцитонин	0,02	Ofoghi et al., 2000

Растения-продуценты фармацевтических белков

За последние несколько лет в ведущих биотехнологических центрах мира созданы трансгенные растения-продуценты широкого спектра гормонов, цитокинов, факторов роста и ферментов, имеющих потенциальное применение в фармакологии (табл. 3). Все они не уступали по биологической активности аналогам, получаемым из других систем экспрессии.

По закону, принятому Всемирной организацией здравоохранения, любые предлагаемые источники лекарствен-ных препаратов, в частности трансгенные растения, должны быть зарегистрированы и пройти серию клинических испытаний. Первые клинические испытания трансгенных растений риса, синтезирующих активный человеческий a-1-антитрипсин для терапии фиброзного кистоза, были начаты в 1998 г.

Производство рекомбинантных белков для медицинских целей с использованием традиционных систем тре-бует значительных финансовых затрат. Так, например, недостаток лизосомального фермента гликоцеребрози-дазы в организме вызывает синдром Гоше. Единственным видом терапии этого заболевания является внутри-венное введение гликоцереброзидазы. Долгое время этот белок получали из плаценты человека, на поддержа-ние жизни одного пациента в течение года требовалось 160000$. Переключение продукции гликоцереброзидазы на культуру клеток млекопитающих снизило стоимость этого препарата, однако не вытеснило его из группы "са-мых дорогих лекарств в мире". В 1999 г. сотрудниками корпорации CropTech было показано, что трансгенные растения способны синтезировать биологически активную гликоцереброзидазу человека. В дальнейшем были получены высокопродуктивные трансгенные растения табака, в которых содержание гликоцереброзидазы чело-века варьировало от 1 до 10 % TSP. Ожидается, что получение рекомбинантной гликоцереброзидазы из таких растений позволит значительно снизить её стоимость (Giddings et al., 2000).

В заключение хотелось бы отметить, что несмотря на значительные достижения в области продукции реком-бинантных белков медицинского назначения в растениях, это направление находится лишь на начальном этапе своего развития. Учёные-биотехно-логи уверены, что в будущем рекомбинантные препараты, получаемые из генетически модифицированных растений, заменят дорогостоящие бактериальные и животные аналоги на фар-мацевтическом рынке. "Съедобные вакцины" позволят значительно усовершенствовать программы всеобщей иммунизации, особенно для населения развивающихся стран.

Список литературы

Arakawa T., Chong D., Merritt J. et al. Expression of cholera and toxin B sub>unit oligomers in transgenic potato plants // Transgenic Res. 1997. V. 6. P. 403-413.

Budar F., Thia-Toong, Van Montagu M. Agrobacterium-mediated gene transfer results mainly in transgenic plants trans-mitting T-DNA as a single Mendelian factor // Genetics. 1986. V. 114. P. 303-313.

Carrillo C., Wigdorovitz A., Oliveros J. et al. Protective immune response to foot-and-mouth disease virus with VP1 ex-pressed in transgenic plants // J. Virol. 1998. V. 72. P. 1688-1690.

Chong D., Roberts W., Arakawa T. et al. Expression of human milk protein b-casein in transgenic potato plants // Trans-genic Res. 1997. V. 6. P. 289-296.

Chong D., Langridge W. Expression of full length bioactive antimicrobial human lactoferrin in potato plants // Transgenic Res. 2000. V. 9. P. 71-78.

Cramer C., Boothe J., Oishi K. Transgenic plants for therapeutic proteins: linking upstream and downstream technolo-gies // Current Topics in Microbiоl. and Immunol. 1999. V. 240. P. 95-118.

Daniell H., Streatfield S., Wycoff K. Medical molecular farming: production of antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants // Trends in Plant Sci. 2001. V. 6. P. 219-226.

Deroles S.C., Gardner R.C. Analysis of the T-DNA structure in a large number of transgenic petunias generated by Agro-bacterium-mediated transformation // Plant Mol. Biol. 1988. V. 11. P. 365-377.

De Cosa B., Moar W., Lee S. et al. Overexpression of Bt cry2Aa2 operon in chloroplasts leads to formation of insecticidal crystals // Nature Biotechnol. 2001. V. 19. P. 71-74.

De la Riva G., Gonzalez-Cabrera J., Vazquez-Padron R., Ayra-Pardo C. Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation // Electronic J. of Biotechnol. 1998. V. 1, № 3. www.ejb.org.

Dieryck W., Pagnier J., Poyart C. et al. Human haemoglobin from transgenic tobacco // Nature. 1997. V. 386. P. 29-30.

Edelbaum O., Stein D., Holland N. et al. Expression of active human interferon-beta in transgenic plants // J. of Interferon Res. 1992 V. 12. P. 449-453.

Finnegan J., McElroy D. Transgene inactivation: Plants fight back! // Bio/Technology. 1994. V. 12. P. 883-887. Fromm E.M., Taylor L.P., Walbot V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electropora-tion // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 5824-5825.

Giddings G., Allison G., Brooks D., Carte A. Transgenic plants as factors for biopharmaceuticals // Nature Biotechnol. 2000. V. 18. P. 1151-1155.

Haq T., Mason H.S., Clements J. et al. Oral immunization with a recombinant bacterial antigen produced in transgenic plants // Science. 1995. V. 268. P. 714-716.

Heberle-Bors E., Charvat B., Thompson D. et al. Genetic analysis of T-DNA insertion into tobacco genome // Plant Cell Rep. 1988. V. 7. P. 571-574.

Hiatt A., Cafferkey R., Bowdish K. Production of antibodies in transgenic plants // Nature. 1989. V. 342. P. 76-78.

Higo K., Saito Y., Higo H. Expression of a chemically synthesized gene for human epidermal growth factor under the control of cauliflower mosaic virus 35S promoter in transgenic tobacco // Bioscience, Biotechnology, Biochemistry. 1993. V. 57. P. 1477-1481.

Horsch R.B., Fraley R.T., Rogers S.G. et al. Inheritance of functional foreign genes in plants // Science. 1984. V. 223. P. 496-499.

Kapusta J., Modelska A., Figlerowicz M. et al. A plant-derived edible vaccine against hepatitis B virus // FASEB J. 1999. V. 13. P. 1796-1799.

Khoudi H., Laberge S., Ferullo J. et al. Production of diagnostic monoclonal antibody in perennial alfalfa plants // Bio-technology and Bioengineering. 1999. V. 64. P. 135-143.

Klein T., Wolf D., Wu R., Sanford J. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells // Nature. 1987. V. 327. P. 70-72.

Kumagai M., Turpen T.H., Weinzettl N. et al. High-level expression of biologically active alpha-trichosanthin in trans-fected plants by an RNA viral vector // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 427-430. Kusnadi A. Production of recombinant proteins in transgenic plants: practical considerations // Biotechnology and Bioen-gineering. 1997. V. 56. P. 473-484.

Leite A., Kemper E. Expression of correctly processed human growth hormone in seeds of transgenic tobacco plants // Mo-lecular Breeding. 2000. V. 6. P. 47-53.

Ma J., Hiatt A., Hein M. et al. Generation and assembly of secretory antibodies in plants // Science. 1995. V. 268. P. 716-719.

Ma J., Hikmat B., Wycoff K. et al. Characterization of a recombinant plant monoclonal secretory antibody and preventive immunotherapy in humans // Nature Medicine. 1998. V. 4. P. 601-606. Mason H., Lam D., Arntzen C. Expression hepatitis B surface antigen in transgenic plants // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 11745-11749.

Mason H., Ball J., Shi J. et al. Expression of Norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral immunogenicity in mice // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1996. V. 33. P. 5335-5340.

Mason H., Haq T., Clements J. et al. Edible vaccine protect mice against Escherichia coli heat-labile enterotoxin (LT): potatoes expressing a synthetic LT-B gene // Vaccine. 1998. V. 16. P. 1336-1343.

Matzke M., Matzke A. How and why do plants inactivate homologous transgenes? // Plant Physiol. 1995. V. 107. P. 679-685.

Matzke A., Neuhuber F., Park Y. et al. Homology-dependent gene silencing in transgenic plants: epistatic silencing loci contain multiple copies of methylated transgenes // Mol. Gen. Genet. 1994. V. 244. P. 219-229.

McGarvey P., Hammond J., Dienelt M. et al. Expression of the rabies virus glycoprotein in transgenic tomatoes // Biotech-nology. 1995. V. 13. P. 1484-1487.

Menassa R., Nguyen V., Jevnikar A. et al. A self-contained system for the field production of plant recombinant inter-leukin-10 // Mol. Breeding. 2001. V. 8. P. 177-185.

Mushegian A., Shepherd R. Genetic elements of plant viruses as tools for genetic engineering // Microbiol. Rev. 1995. V. 12. P. 548-578.

Neuhaus G., Spandenberg G., Mittelstein O. et al. Transgenic rapesee plants obtained by the microinjection of DNA into microspore-derived embryoids // Plant J. 1987. V. 75. P. 30-36.

Ofoghi H. Cloning and expression of human calcitonin genes in transgenic potato plants // Biotechnol. Lett. 2000. V. 22. P. 611-615.

Park Y., Cheong H. Expression and production of recombinant human interkeukin-2 in potato plants // Protein Expres-sion and Purification. 2002. V. 25. P. 160-165.

Parmenter D., Boothe J.G., van Rooijen G. et al. Production of biologically active hirudin in plant seeds using oleosin partitioning // Plant Mol. Biol. 1995. V. 29. P. 1167-1180.

Porta C., Spall V., Lin T. et al. The development of cowpea mosaic virus as a potential source of novel vaccines // Intervi-rology. 1996. V. 39. P. 79-84.

Richter L., Thanavala Y., Arntzen C. et al. Production of hepatitis B surface antigen in transgenic plants for oral immuni-zation // Nature Biotechnol. 2000. V. 18. P. 1167-1171.

Ruggiero F., Exposito J., Bournat P. et al. Triple helix assembly and processing of human collagen produced in trans-genic tobacco plants // FEBS Lett. 1990. V. 469. P. 132-136.

Russel C., Clarke L. Recombinant proteins for genetic disease // Clinical Genet. 1999. V. 55. P. 389-394.

Sardana R., Alli Z., Dudani A. et al. Biological activity of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor is maintained in a fusion with seed glutelin peptide // Transgenic Res. 2002. V. 5. P. 521-531.

Sijmons P., Dekker B., Schrammeijer B. et al. Production of correctly processed human serum albumin intransgenic plants // Bio/Technology. 1990. V. 8. P. 217-221.

Staub J., Garcia B., Graves J. et al. High-yield production of a human therapeutic protein in tobacco chloroplasts // Na-ture Biotechnol. 2000.V. 18. P. 333-338.

Stoger E., Vaquero C., Torres E. et al. Cereal crops as viable production and storage systems for phar-maceutical scFv antibodies // Plant Mol. Biol. 2000. V. 42. P. 583-590.

Streatfield S., Jilka J., Hood E. et al. Plant-based vaccines: unique advantages // Vaccine. 2000. V. 19. P. 2742-2748.

Tackaberry E., Dudani A., Prior F. et al. Development of biopharmaceuticals in plant expression systems: cloning, ex-pression and immunological reactivity of human cytomegalovirus glycoprotein B (UL55) in seeds of transgenic to-bacco // Vaccine. 1999. V. 17. P. 3020-3029.

Tacket C., Mason H., Losonsky G. et al. Human immune responses to a novel Norwalk virus vaccine delivered in trans-genic potatoes // J. of Infectious Diseases. 2000. V. 182. P. 302-305.

Tacket C., Mason H. A review of oral vaccination with transgenic vegetables // Microbes and Infection. 1999. V. 1. P. 777-783.

Thanavala Y., Yang Y., Lyons P. et al. Immunogenicity of transgenic plant-derived hepatitis B surface antigen // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 3358-3361.

Torres E., Vaquero C., Nicholson L. et al. Rice cell culture as an alternative production system for functional diagnostic and therapeutic antibodies // Transgenic Res. 1999. V. 8. P. 441-449.

Tuboly T., Yu W., Bailey A. et al. Immunogenicity of porcine transmissible gastroenteritis virus spike protein ex-pressed in plants // Vaccine. 2000. V. 18. P. 2023-2028.

Vandekerckhove J. Enkephalines produced in transgenic plants using modified 2S storage proteins // Bio/Technology. 1989. V. 7. P. 929-932.

Vaucheret H., Beclin C., Fagard M. Post-transcrip-tional gene silencing in plants // J. Cell Sci. 2001. V. 114. P. 3083-3091.

Walmsley A., Arntzen C. Plants for delivery of edible vaccines // Current Opinion in Biotechnol. 2000. V. 11. P. 126-129.

Wigdorovitz A., Carrillo C., Dus Santos M. et al. Induction of a protective antibody response to foot and mouth disease in mice following oral or parenteral immunization with alfalfa transgenic plants expressing the viral structural protein VP1 // Virology. 1999. V. 255. P. 347-353.

Zeitlin L., Olmsted S., Moench T. et al. A humanized monoclonal antibody produced in transgenic plants for immunoprotec-tion of the vagina against genital herpes // Nature Biotechnol. 1998. V. 16. P. 1361-1364.

Zhong G., Peterson, D., Delaney D. et al. Commercial production of aprotinin in transgenic maize seeds // Mol. Breeding. 1999. V. 5. P. 345-356.

¹ А.А. Турчинович, аспирант

¹ Е.В. Дейнеко, к.б.н., зам. зав. лабораторией гетерозиса растений

² М.Л. Филипенко, к.б.н., зав. сектором фармакогеномики

² Е.А. Храпов, ст. инженер сектора фармакогеномики

¹ В.К. Шумный, академик

¹ Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск

² Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск