Белки (работа 10)
БЕЛКИ
Любое соединение, которое содержит одновременно карбоксильную и аминогруппу, является аминокислотой. Однако, чаще этот термин применяется для обозначения карбоновых кислот, аминогруппа которых находится в -положении к карбоксильной группе.
Аминокислоты, как правило, входят в состав полимеров - белков. В природе встречается свыше 70 аминокислот, но только 20 играют важную роль в живых организмах. Незаменимыми называются аминокислоты, которые не могут быть синтезированы организмом из веществ, поступающих с пищей, в количествах, достаточных для того, чтобы удовлетворить физиологические потребности организма. Незаменимые аминокислоты приводятся в табл. 1. Для больных фенилкетонурией незаменимой аминокислотой является также тирозин (см. табл. 1).
Таблица 1. Незаменимые аминокислоты R-CHNH>2>COOH
|
Название (сокращение) |
R |
|
изолейцин (ile, ileu) |
CH>3>CH>2>CH(CH)>3>- |
|
лейцин (leu) |
(CH>3>)>2>CHCH>2>- |
|
лизин (lys) |
NH>2>CH>2>CH>2>CH>2>CH>2>- |
|
метионин (met) |
CH>3>SCH>2>CH>2>- |
|
фенилаланин (phe) |
C>6>H>5>CH>2>- |
|
треонин (thr) |
CH>3>CH(OH)- |
|
триптофан (try) |
|
|
валин (val) |
(CH>3>)>2>CH- |
|
тирозин (tyr) |
Аминокислоты называют обычно как замещенные соответствующих карбоновых кислот, обозначая положение аминогруппы буквами греческого алфавита. Для простейших аминокислот обычно применяются тривиальные названия (глицин, аланин, изолейцин и т.д.). Изомерия аминокислот связана с расположением функциональных групп и со строением углеводородного скелета. Молекула аминокислоты моет содержать одну или несколько карбоксильных групп и в соответствии с этим аминокислоты различаются по основности. Также в молекуле аминокислоты может находиться разное количество аминогрупп.
Аминокислоты способны к поликонденсации, в результате которой образуется полиамид. Полиамиды, состоящие из -аминокислот, называются пептидами или полипептидами. Амидная связь в таких полимерах называется пептидной связью. Полипептиды с молекулярной массой не меньше 5000 называют белками. В состав белков входит около 25 различных аминокислот. При гидролизе данного белка могут образовываться все эти аминокислоты или некоторые из них в определенных пропорциях, характерных для отдельного белка.
Уникальная последовательность аминокислотных остатков в цепи, присущая данному белку, называется первичной структурой белка. Особенности скручивания цепей белковых молекул (взаимное расположение фрагментов в пространстве) называются вторичной структурой белков. Полипептидные цепи белков могут соединяться между собой с образованием амидных, дисульфидных, водородных и иных связей за счет боковых цепей аминокислот. В результате этого происходит закручивание спирали в клубок. Эта особенность строения называется третичной структурой белка. Для проявления биологической активности некоторые белки должны сначала образовать макрокомплекс (олигопротеин), состоящий из нескольких полноценных белковых субъединиц. Четвертичная структура определяет степень ассоциации таких мономеров в биологически активном материале.
Белки делятся на две большие группы - фибриллярные (отношение длины молекулы к ширине больше 10) и глобулярные (отношение меньше 10). К фибриллярным белкам относится коллаген, наиболее распространенный белок позвоночных; на его долю приходится почти 50% сухого веса хрящей и около 30% твердого вещества кости. В большинстве регуляторных систем растений и животных катализ осуществляется глобулярными белками, которые носят название ферментов.
Для полипептидов существует специальная номенклатура. Аминокислота со свободной аминогруппой на конце полипептидной цепи называется N-концевой аминокислотой, а аминокислота со свободной карбоксильной группой на другом конце этой молекулы - С-концевой аминокислотой. Аминокислотные остатки в полипептидной цепи нумеруются по порядку, начиная с N-концевой аминокислоты, которая обозначается цифрой 1. Полипептиды называются как производные С-концевой аминокислоты, причем первой пишут название N-концевой аминокислоты, а последней - С-концевую аминокислоту. Так, глицилаланин - это дипептид, состоящий из глицина (N-концевая аминокислота) и аланина (С-концевая аминокислота). В сокращенном виде название пишут gly-ala. Аланилглицин (ala-gly) - это изомерный дипептид, в котором N-концевой аминокислотой является аланин, а С-концевой - глицин.
АНАЛИЗ БЕЛКОВ
Белки, как и прочие амиды гидролизуются под действием кислот и щелочей. После полного гидролиза можно установить качественный и количественный аминокислотный состав, но не точную последовательность аминокислот. Если перед гидролизом обработать полипептид реактивом Сэнгера, то можно будет затем идентифицировать N-концевую аминокислоту, так как она даст устойчивое окрашенное производное анилина, которое не разрушается при гидролизе.
В результате неполного гидролиза образуются небольшие пептидные фрагменты. Меняя условия гидролиза, можно разбивать полипептид на различные фрагменты, которые перекрываются по составляющим их аминокислотным остаткам. Для воссоздания первичной структуры необходимо идентифицировать аминокислоты, которые входят в состав каждого из фрагментов, и определить последовательность, в которой эти аминокислоты соединяются друг с другом в исходном полипептиде. Для этого можно провести полный гидролиз фрагментов, идентифицировать аминокислоты, а затем осуществить химический синтез фрагментов. Существует и другой путь - избирательный гидролиз. В этом случае от фрагмента отщепляют по одной аминокислоте на каждом этапе, чаще всего при помощи ферментов поджелудочной железы (карбоксипептидаз). Эти ферменты способны гидролизовать только С-концевые аминокислоты и, следовательно, разрушать пептидный фрагмент с С-конца.
N-концевую кислоту можно удалить при помощи фенилизотиоцианата. В результате следующая аминокислота становится N-концевой, ее также можно отщепить действием фенилизотиоцианата и т.д. (деградация по Эдману).
В результате реакции фенилизотиоцианата с N-концевой аминокислотой образуется аддукт (тиомочевина), который циклизуется в уксусной кислоте. При кислотном гидролизе аддукт расщепляется, давая N-концевую аминокислоту и неустойчивое промежуточное соединение, которое изомеризуется в тиогидантоин. Специфический тиогидантоин служит для идентификации первой N-концевой аминокислоты. Проводя во второй раз всю последовательность реакций, можно определить следующую аминокислоту, так как она стала N-концевой в результате деградации по Эдману.
СИНТЕЗ БЕЛКОВ
Реакции, протекающие при синтезе белка - см. Реакции аминокислот. Вышеприведенная схема допускает некоторые изменения - например, для активации карбоксильной группы вместо этилхлорформиата используют дициклогексилкарбодиимид. В любом случае, синтез белка по этой схеме требует нескольких стадий, что и служит ограничением использования этого метода.
Для синтеза белков стали применять метод, впервые предложенный Р. Меррифилдом и получивший название твердофазного синтеза пептидов (ТФСП). На первой стадии синтеза аминокислоту, которая будет стоять на С-конце будущего белка, присоединяют через ее карбоксильную группу к полимеру. При этом нередко используют образование эфирной связи между этой группой и хлорметильной группой полимера:
Затем проводят ацилирование свободной аминогруппы этой аминокислоты путем реакции с дициклогексилкарбодиимидом и другой аминокислотой, которая содержит защищенную аминогруппу. В результате образуется первая пептидная связь:
После удаления трет-бутоксикарбонильной группы и нейтрализации полимер, несущий пептид, готов для следующей стадии ацилирования:
Вслед за присоединением последнего аминокислотного остатка аддукт полипептида и полимера обрабатывают смесью бромистого водорода и трифторуксусной кислоты. В результате полипептид освобождается от полимера, а с N-концевой аминокислоты снимается защитная группа.
Преимущество этого метода по сравнению с классическими методами синтеза состоит в том, что ни на одной из стадий не требуется выделения полипептидной цепи. В силу чрезвычайно низкой растворимости аддукта пептида и полимера легко отмывается после каждой реакции от побочных продуктов, растворителей и избытка реагентов без потери пептида, после чего аддукт готов к следующей реакции. В настоящее время метод автоматизирован, и запрограммированные аминокислотные синтезаторы могут без труда присоединить шесть аминокислот к растущей полипептидной цепи за 24 ч. Эти приборы добавляют реактивы в надлежащей последовательности, меняют условия реакций, обеспечивают необходимое время реакций, отмывают побочные продукты, после чего начинают операцию снова. С помощью метода ТФСП были синтезированы инсулин и фермент рибонуклеаза, состоящий из 124 аминокислот.