Стафилококки — возбудители пищевых токсикозов

Курсовая работа

"Стафилококки – возбудители пищевых токсикозов"

Москва 2006

Введение

Продукты убоя животных при определенных условиях могут быть источником возникновения не только типичных инфекционных и инвазионных болезней у людей (сибирская язва, туберкулез, бруцеллез, тениаринхоз, тениидоз и др.), но и различных пищевых заболеваний, к которым относят токсикоинфекции и токсикозы. Токсикоинфекции и токсикозы представляют собой обширную группу преимущественно острых пищевых заболеваний людей. Само название «пищевые заболевания», «пищевые токсикоинфекции», «пищевые токсикозы» указывают, что основную роль 'в их возникновении играют пищевые продукты. Однако возможное вредное влияние пищевых продуктов на организм человека может быть обусловлено различными причинами. В зависимости от них все пищевые заболевания людей делят на две большие группы.

Пищевые заболевания бактериального или микробного происхождения.

В соответствии с современной классификацией, утвержденной в 1981 году Минздравом СССР, пищевые отравления микробной природы разделены на пищевые токсикоинфекции, пищевые токсикозы (интоксикации) и отравления смешанной этиологии (при сочетании пищевой токсикоинфекции и токсикоза).

Пищевые токсикоинфекции – заболевания, вызываемые микроорганизмами в сочетании с токсическими веществами, образующимися в процессе их жизнедеятельности (преимущественно эндотоксинами). Данные микроорганизмы–это бактерии рода сальмонелла, некоторые условно-патогенные бактерии (E. coli, Proteus mirabilis), Cl. perfringens. В. cereus и др.

Пищевыми токсикозами (интоксикациями) называют пищевые отравления, связанные с употреблением в пищу продуктов, в которых накопился экзотоксин в результате жизнедеятельности токсинобразующих микроорганизмов.

После употребления человеком продуктов, содержащих экзотоксин, последний всасывается через желудочно-кишечный тракт в кровь и разносится по всему организму. При этом поражаются в первую очередь сердечнососудистая и центральная нервная системы. Появляются головные боли, головокружение, нарушаются зрение, функции сердечнососудистой системы и др. Позже появляются признаки нарушения функций желудочно-кишечного тракта рвота, диарея, боль в области желудка и др.

Инкубационный период при токсикозах короче, чем при пищевых токсикоинфекциях, и составляет несколько часов.

Возбудителями пищевых токсикозов являются патогенные стафилококки, стрептококки, возбудитель ботулизма и токсигенные грибы. Токсикозы грибного происхождения называют микотоксикозами.

1. Краткая историческая справка и классификация

Среди микроорганизмов, вызывающих пищевые токсикозы, значительная роль принадлежит токсигенным стафилококкам.

Стафилококки впервые выделены из гноя фурункула человека Л. Пастером в 1880 г. Различают сапрофитные, условно-патогенные и патогенные виды стафилококков. Сапрофитные виды содержатся в воздухе, почве, воде, на поверхности растений. Условно-патогенные и патогенные обитают в организме людей и животных: на коже и слизистых оболочках. Патогенные стафилококки часто обусловливают гнойно-воспалительные процессы – маститы, флегмоны, нагноения ран и др. В связи с этим их называют пиогенными или гноеродными. Они также вызывают пищевые токсикозы у людей. Заболевания возникают часто в результате употребления молока и молочных продуктов, содержащих экзотоксины этих микроорганизмов.

Классификация стафилококков была впервые разработана в 1884 г. Розенбахом. На плотной питательной среде были выделены два типа колоний: один тип колоний образовывал желтый пигмент, другой – белый. Долгое время стафилококки ошибочно классифицировали по пигменту. По современной классификации стафилококки относят Их относят к семейству Мicroсоссасеае, роду Staphylococcus, который представлен 28 видами, который включает три вида: золотистый стафилококк (S.aureus) – патогенный; эпидермальный (S. epidermidis) – условно-патогенный; сапрофитический (S. saprophyticus) – непатогенный. Пищевые токсикозы (интоксикации) вызывают S.aureus и S. epidermidis, способные вырабатывать экзотоксин, именуемый энтеротоксином и коагулировать цитратную плазму кролика.

Стафилококки представляют собой круглые клетки (кокки) диаметром 0,8–1 мкм, располагающиеся в виде скоплений, напоминающих виноградные грозди, иногда располагаются в виде коротких цепочек или парными и одиночными клетками. Они неподвижны, спор и капсул не образуют, красятся всеми анилиновыми красителями, грамположительны.

2. Культуральные свойства

Стафилококки – аэробы и факультативные анаэробы. Хорошо развиваются на обычных питательных средах при температуре от 10°С до 43°С (оптимум 30–37°С) при рН – 7,2–7,6. Рост возможен и в слабокислой среде. Стафилококки вызывают диффузное помутнение МПБ с последующим выпадением небольшого осадка. Через 2–3 суток на поверхности бульона образуются пленка и пристеночное кольцо. На МПА стафилококки растут в виде выпуклых, с ровными краями колоний диаметром от 1 до 4 мм. При 20–25°С, доступе кислорода и рассеянном свете стафилококки вырабатывают золотистый, белый, лимонно-желтый, оранжевый и другие пигменты, являющиеся липохромами, каталазоположительны, оксидазоотрицательны. Растут на средах с 5–10% NаС1.

В качестве избирательных сред предложены; желточно-солевой агар, молочно-солевой агар, Чепмена и др. Чаще всего используют среду ЖСА (желточно-солевой агар), позволяющую уже в первичных посевах выявить колонии патогенных стафилококков.

При росте на желточно-солевом агаре вокруг колоний патогенных стафилококков образуются радужные венчики и зоны помутнения. На молочно-солевом агаре колонии стафилококков имеют форму дисков с ровными краями, образующие разнообразные пигменты (золотистый, белый и др.).

Ввиду сходства стафилококков по морфологии и культуральным свойствам, выросшие на питательных средах колонии отвивают на скошенный мясопептонный агар и проводят идентификацию: ставят реакцию плазмокоагуляции (патогенные стафилококки способные коагулировать цитратную кроличью плазму, как правило лизируются фагами), каталазный тест, проводят посевы на углеводные среды с маннитом и др., на МПЖ, проверяют чувствительность к антибиотикам.

Подразделение стафилококков на подвиды или варианты по характеру пигмента имеет второстепенное значение и при санитарно-микробиологических исследованиях не должно приниматься во внимание. Ненадежно также определение патогенных стафилококков по их способности давать гемолиз при росте на кровяном агаре. Гемолитическая способность этих микробов колеблется в широких пределах в зависимости от ряда факторов: вида используемой крови, содержание в ней антигоксина, концентрации эритроцитов в агаре, толщина слоя среды и др. Поэтому гемолитический признак на практике не обеспечивает дифференциацию гноеродных (патогенных) стафилококков от сапрофитных видов. Поэтому при санитарно-микробиологических исследованиях учитывают только типичные коагулазопозитивные штаммы гноеродных стафилококков.

Реакция плазмокоагуляции. В пробирку с 0,5 см³ стерильной плазмы крови вносят одну бактериальную петлю агаровой али 0,1 см³ бульонной 18–24-часовой культуры испытуемого микроорганизма, инкубируют при 37°С и учитывают результат через 30 мин, 2,4 и 24 ч. При положительном результате образуется плотный или рыхлый сгусток. Если использовали разведенную плазму, то сгусток плавает в жидкости.

Приготовление плазмы. Используют кровяную плазму кролика цельную или разведенную физиологическим раствором 1:2 – 1:4. Взятую у кролика из сердца (в стерилъных условиях) около 10 см крови помещают в пробирку с 1 см 5%-го стерильного раствора лимоннокислого натрия, тщательно перемешивают, центрифугируют. Плазму (надосадочную жидкость) переносят в стерильные пробирки и хранят в холодильнике при +4-+6°С – 4–5 сут. Можно использовать для реакции плазмокоагуляции сухую кроличью плазму биофабричного производства

Стафилококки достаточно активны в биохимическом отношении. Они ферментируют ряд углеводов до кислоты без газа: маннит, лактозу, глюкозу, сахарозу, мальтозу. Патогенные стафилококки разжижают желатин, свертывают, а затем пептонизируют молоко, вызывают гемолиз эритроцитов. Образуют сероводород, индол не выделяют. Продуцируют каталазу, уреазу, аммиак и водород. Патогенные стафилококки выделяют ряд ферментов: плазмокоагулазу, желатиназу, липовителлин, ДНК-азу, бета-лакталазу, фибринолизин, лизоцим и др., кроме того, выделяют энтеротоксин, лейкоцидин, токсин общего летального действия и др.

Среди неспорообразующих микробов стафилококки наиболее устойчивы к различным физическим и химическим факторам. В высушенных субстратах они сохраняются более 6 месяцев не теряя вирулентности, в пыли – 50–100 дней, в течение нескольких часов они выдерживают действие прямых солнечных лучей. Нагревание до 70°С выдерживают более 1 часа, при кипячении погибают мгновенно (за исключением энтеротоксина, выделяемого токсигенными штаммами стафилококков). В мясных хлебах погибают только при достижении в центре батона температуры 85–90°С. Низкие температуры подавляют жизнедеятельность стафилококков (их размножение и токсинообразование), но не убивают их. Так при -10 –-18°С в тушках птиц стафилококки сохраняют свою жизнеспособность и токсигенность в течение 35 месяцев. 5%-й раствор фенола действует губительно после 30-минутного воздействия. Стафилококки чувствительны к анилиновым красителям (особенно к бриллиантовому зеленому) и некоторым антибиотикам. Резистентны к действию чистого этанола и к препаратам хлора.

Патогенные стафилококки обладают способностью продуцировать токсины: летальный, гемолитический, некротический, лейкоцидин, энтеротоксин. Кроме токсинов патогенные стафилококки вырабатывают ферментативные субстанции (фибринолизин, гиалуронидазу, плазмокоагулазу, лецитиназу), усиливающие действие токсинов на организм. Наиболее патогенен золотистый стафилококк, который выделяет экзотоксины, обусловливающие пищевые отравления. Стафилококк, образующий энтеротоксин, впервые был выделен из вымени коровы, больной маститом. Энтеротоксин термостабилен, не разрушается в течение 30 минут при 100ºС, не утрачивает токсических свойств под действием формалина. При скармливании продуктов, содержащих токсины, котятам, крольчатам, белым мышам они быстро погибают.

Патогенные стафилококки содержат протеиновый и полисахаридный антигены. Протеиновый антиген, общий для всей группы стафилококков, обладает видовой специфичностью, он нетоксичен для животных. Полисахаридный антиген специфичен для различных типов стафилококков. Он содержит энтеротоксины A, B, C, D. Наиболее часто пищевые интоксикации вызывает энтеротоксин А («пищевой» – токсин), устойчивый к нагреванию. Энтеротоксин В («кишечный» – токсин) термолабилен, обусловливает возникновение энтеритов у детей, его часто обнаруживают в продуктах, вызывающих интоксикацию. Энтеротоксин С вызывает рвоту у обезьян, а энтеротоксин D – у кошек.

Патогенные стафилококки вызывают местные гнойные воспалительные процессы: фурункулы, абсцессы, флегмоны, маститы, нагноение раны. Из домашних животных к стафилококковой инфекции наиболее восприимчивы лошади, собаки, крупный и мелкий рогатый скот, свиньи; из лабораторных–кролики, белые мыши.

3. Источники обсеменения продуктов стафилококками

Чаще всего причиной стафилококковых токсикозов является употребление молока, мяса и мясных изделий, кондитерских изделий с заварным кремом и др., контаминированных патогенными стафилококками.

Органолептические свойства продуктов, в которых размножаются стафилококки и накапливаются энтеротоксины, не изменяются.

Основными источниками обсеменения стафилококками пищевых продуктов являются люди и животные с гнойно-воспалительными процессами (абсцессы, фурункулы, гнойные раны и др.), а также носители этих микроорганизмов. Перенос стафилококков от людей на пищевые продукта может происходить воздушно-капельным путем, при непосредственном контакте людей с продуктами, оборудованием, тарой и т.д., а также в процессе убоя скота и разделки туш.

В связи с тем, что основным источником обсеменения сборного молока стафилококками является молоко, полученное от коров, больных маститом, необходимо выявлять больных животных, особенно с субклиническими формами маститов, и не допускать смешивания маститного и сборного молока.

Источником обсеменения молока патогенными стафилококками могут быть люди с гнойничковыми поражениями кожи (фурункулами, абсцессами, нагноившимися ранами и царапинами), а также больные ангиной. Такие люди не должны допускаться к работе на пищевых предприятиях.

Энтеротоксигенные стафилококки размножаются в пищевых продуктах даже при содержании в них около 40% влаги. Они могут развиваться в продуктах, содержащих от 7% до 12% хлорида натрия. Сахар угнетает развитие стафилококков при концентрациях 30–40%. Некоторые микроорганизмы (В. сеreus, дрожжи из рода Саndidа и др.) оказывают на стафилококки стимулирующий эффект (они усиливают образование энтеротоксина).

При благоприятных температурных условиях энтеропатогенные стафилококки быстро размножаются в продуктах и продуцируют токсин (энтеротоксин). Пищевые токсикозы, вызванные энтеропатогенными стафилококками, протекают в форме острого гастроэнтерита, сопровождающегося рвотой, реже диареей, головной болью. Инкубационный период очень короткий – от 30 мин до 6 ч. Длится заболевание один, реже – два, три дня.

Энтеротоксин стафилококков обладает высокой термоустойчивостью. Инактивирование (разрушение) токсина происходит только через 2,5–3 часа кипячения. При автоклавировании (120°С) токсин разрушается через 20 мин.

4. Диагностика

Диагноз стафилококковых токсикозов ставят на основании клинической картины болезни и эпидемиологических данных.

Микробиологические исследования вспышек стафилококковых токсикозов ведется в следующих направлениях:

выделение возбудителя от пострадавших (из промывных вод желудка, рвотных масс, испражнений) и остатков пищевых продуктов; в случае выделения культуры стафилококка проводят идентификацию до фаговара;

определение в исследуемом материале (или выделенной культуры) энтеротоксина;

обнаружение источника инфицирования продукта или носительства среди людей, принимавших участие в приготовлении пищевого продукта, послужившего причиной отравления.

При отсутствии иммунных сывороток к стафилококковым энтеротоксинам можно поставить биологическую пробу на щенках собак или на котятах в возрасте 1–2,5 мес. Животным скармливают подозреваемый продукт или фильтрат выделенных культур стафилококков. Через 30–60 мин у животных наблюдаются симптомы гастроэнтерита: рвота, диарея, после прекращения которых животные выздоравливают.

При пищевых отравлениях исследуют остатки пищевых продуктов, рвотные массы, промывные воды и испражнения больных, преследуя две цели: выделение стафилококков и обнаружение энтеротоксина.

Для выявления патогенных стафилококков делают посевы в жидкую накопительную среду, содержащую 10–15% хлористого натрия. После 24–48-часового термостатирования проводят посев на МПА и идентифицируют патогенные стафилококки Дифференциацию патогенных и сапрофитных стафилококков проводят по способности вызывать коагуляцию плазмы и по чувствительности к бактериофагам.

В настоящее время выделено около 40 различных фаготипов стафилококков. Фаготипизирование имеет большое значение для дифференциации стафилококков и определения источников загрязнения продуктов. При дифференциации патогенных и сапрофитных стафилококков учитывают также пигментообразование, ферментацию маннита и гемолитические свойства. В качестве элективно-дифференциальных сред используют молрчно-солевой и кровяно-солевой агар. Чистую культуру стафилококков из фекалий, рвотных масс получают на среде Чепмена, которая содержит 7% хлористого натрия, кристалл-виолет, лактозу или на желточно-солевом агаре (ЖСА) с 10% поваренной соли в 10–20% желточной взвеси. Большая концентрация хлористого натрия подавляет развитие посторонней микрофлоры, но не препятствует росту стафилококков.

Наличие энтеротоксина в исследуемом материале устанавливают по реакции преципитации в агаре с моно-специфическими антиэнтеротоксическими сыворотками, а также по результатам биологической пробы. В лабораториях биологическую пробу ставят на котятах или щенках. Лабораторные животные погибают через 15–20 мин после внутривенного или внутрибрюшинного введения фильтрата бульонных культур или экстрактов из материала. У животных после скармливания остатков пищевых продуктов через 3–6 ч возникает рвота, диарея.

5. Выявление и определение количества стафилококков в пищевых продуктах

Выявление и определение количества этих микроорганизмов в пищевых продуктах проводят в соответствии с ГОСТ 10444.2–94. Для этого делают посев в жидкую селективную среду (с предварительным обогащением) и на агаризованные селективно-диагностические среды. Посев делают в жидкие среды, если в навеске менее 150 (15) колониеобразующих единиц (КОЕ), и на плотные среды, если в навеске (объеме) более 150 (15) КОЕ.

При содержании в 1 г твердого продукта менее 1 500 КОЕ (или в 1 см³ жидкого продукта менее 150 КОЕ) определяют наиболее вероятное число (НВЧ) посевом в жидкую селективную среду. При подозрении на наличие в 1 г (1 см³) жидкого продукта более 1500 (150) КОЕ этого вида микроорганизмов посев проводят на плотные селективно-диагностические среды.

Методы выявления и определения НВЧ S.aureus с предварительным обогащением предусматривают высев навески продукта и (или) ее разведений в жидкую селективную среду, инкубирование посевов, пересев на агаризованные селективно-диагностические среды, подтверждение по биохимическим признакам принадлежности выделенных культур к S.aureus.

Выявление и определение количества S.aureus с использованием агаризованных селективно-диагностических сред включают следующие стадии: высев навески или разведения навески продукта; инкубирование посевов; подсчет колоний с характерными для S.aureus признаками; идентификацию выделенных культур.

Из навески продукта готовят исходное и ряд 10-кратных разведений так, чтобы можно было определить в 1 г (см³) продукта предполагаемое или указанное в нормативно-технической документации количество S.aureus Степень разведения навески для посева на плотные среды выбирают такой, чтобы общее количество колоний, выросших на чашке Петри, было в пределах 15–300, а в жидких средах, чтобы хотя бы в одной пробирке с наибольшим разведением отсутствовали микроорганизмы.

При определении количества S.aureus посевом на агаризованные селективно-диагностические среды по 0,1 или 0,2 см³ продукта (или его разведения) наносят на поверхность агара Байрда–Паркера, молочно-солевого, яично-желточно-азидного или яично-желточно-солевого агара в двух чашках.

При определении количества S.aureus по методу НВЧ высевают три последовательные навески продукта и (или) его разведения, отличающиеся по количеству продукта в них в 10 раз. Каждую навеску продукта и (или) его разведение в трехкратной повторности высевают в колбу или пробирки с одной из сред. Соотношение между количеством высеваемого продукта (или его разведения) и питательной средой 1:6 или 1:7.

Самое низкое разведение и высеваемые объемы выбирают в зависимости от предполагаемого количества микроорганизмов и чувствительности метода следующим образом:

по 1 см³ из разведения 10^-1 и более высокого, если надо определить количество микроорганизмов, превышающее 3 клетки в 1 г (1 см³) продукта;

по 10 см³ из разведения 10^-1 или 1 см³ неразведенного продукта и по 1 см³ из разведения 10^-1 и более высокого, если надо определить количество микроорганизмов, превышающее 3 клетки в 10 г. (10 см³) продукта;

по 10 и 1 см³ неразведенного продукта и ряда его разведений, если надо определить количество микроорганизмов, превышающее 3 клетки в 100 см³ продукта.

Все разведения и неразведенный продукт высевают параллельно в три пробирки с 10 см³ питательной среды. В среду нормальной концентрации высевают 1 см³, двойной концентрации – 10 см³.

При выявлении S.aureus в определенной навеске продукта (или его эквивалентном разведении) с предварительным обогащением эту навеску (разведение) вносят в одну из питательных сред в соотношении 1:6 или 1:7.

При анализе пищевых продуктов с высоким содержанием NaС1 проводят посев продукта (или его исходного разведения) в сахарный бульон. Во всех других случаях для посева используют солевой бульон.

При выявлении S.aureus в определенной навеске продукта (или его эквивалентном разведении) без предварительного обогащения эту навеску (разведение) в количестве 0,1 г (или 0,2 см³) наносят на поверхность одной из селективно-диагностических сред. Посевы инкубируют в термостате при 36 ± 1°С в течение 48 ч, чашки Петри ставят дном вверх.

Для подтверждения роста микроорганизмов в жидких средах из них делают пересевы петлей на поверхность одной из селективно-диагностических сред, помещают в термостат при 36±1°С на 24–48 ч и затем проводят учет.

Характерные признаки роста S.aureus на плотных средах приведены ниже.

Агар Байрда–Паркера Колонии черные, блестящие, круглые, диаметром 1,5 – 2,5 мм, окружены зоной лецитиназной активности

Агар молочно-солевой Колонии черные, блестящие, круглые, диаметром 1,5–2,5 мм, окружены зоной лецитиназной активности

Агар яично-желточно – азидный и яично-желточно-солевой

Колонии черные, блестящие, круглые, диаметром 1,5–2,5 мм, окружены зоной лецитиназной активности

Колонии круглые, диаметром 2–2,5 мм, слегка возвышающиеся над поверхностью агара, с ровными края ми, окрашены в желтый, золотистый, лимонно-желтый, кремовый, палевый или белый цвет

Для подсчета количества S.aureus отбирают чашки, на которых выросло от 15 до 150 характерных колоний. Для подтверждения наличия в продукте стафилококка отбирают не менее 5 характерных колоний и пересевают на скошенный мясопептонный агар. Через 24 ч после термостатирования при 36+1°С определяют морфологию в мазках, окрашенных по Граму, способность коагулировать плазму крови кролика, образовывать каталазу и ферментировать мальтозу в анаэробных условиях.

S.aureus – грамположительные клетки шарообразной формы диаметром 0,6–1 мкм, располагающиеся чаще (но не всегда) в виде скоплений, напоминающих гроздья винограда.

Способность выросших микроорганизмов образовывать каталазу определяют по методу, указанному выше. S.aureus образует каталазу. У грамположительных микроорганизмов, образующих каталазу, выявляют способность коагулировать плазму крови кролика. Для этого к плазме крови кролика добавляют по одной петле испытуемых культур, оставляя одну пробирку с разведенной плазмой незасеянной (контроль). Внесенную культуру тщательно размешивают и пробирку помещают в термостат при 36±1°С. Если через 6 ч коагуляции плазмы не произошло, то пробирку оставляют при 30+1°С на 24 ч. Если плазма не скоагулировала, то испытуемую культуру стафилококка относят к коагулазоотрицательной. Реакцию плазмокоагуляции считают отрицательной и в случаях, когда в плазме не образуются отдельные нити или сгустки либо появляются единичные нити (реакцию оценивают одним плюсом).

Реакцию считают положительной, если в плазме образовался небольшой компактный сгусток (два плюса); большой уплотненный сгусток (три плюса); плазма вся скоагулировала, сгусток не меняет своего положения при перевертывании пробирки (четыре плюса).

Для ускорения выявления коагулазоположительных стафилококков вместо агаровых культур допускается применять культуру, выращенную на мясопептонном бульоне. Ее используют для постановки реакции плазмокоагуляции спустя 2 ч после появления видимых признаков роста микроорганизмов. К 0,5 см³ разведенной плазмы добавляют 2 капли суточной бульонной культуры, учет результатов проводят в сроки от 30 мин до 2–4 ч. Реакцию оценивают плюсами (от одного до четырех).

Способность ферментировать мальтозу в анаэробных условиях определяют с целью дифференциации S.aureus от других коагулазоположительных видов – S. intermedius и S. hyicus sub>sp. hyicus (S.aureus ферментирует мальтозу в анаэробных условиях, S. intermedius ферментирует ее слабо, S. hyicus sub>sp. hyicus не ферментирует). Культуры, подлежащие исследованию, высевают уколом петлей в среду Гисса с мальтозой. На поверхность среды наслаивают голодный агар высотой 2–2,5 см. Посевы инкубируют при 36±1°С в течение 48 ч. При ферментации мальтозы в анаэробных условиях с образованием кислоты цвет среды Гисса изменится.

Если в посевах обнаружены грамположительные кокки, способные коагулировать плазму крови, образующие каталазу, ферментирующие мальтозу в анаэробных условиях, то выявленные микроорганизмы относят к S.aureus.

При определении потенциальной энтеротоксичности выделенных культур S.aureus устанавливают их способность образовывать термостабильную нуклеазу. Для этого в среде с ДНК, разлитой в чашки Петри, вырезают асептически «колодцы» диаметром не более 4 мм, на расстоянии не менее 7–8 мм друг от друга. Культуры,

выросшие на мясопептонном бульоне после инкубирования при 36±1°С в течение 24 ч, прогревают на кипящей водяной бане 15 мин, охлаждают до комнатной температуры и вносят по 1–2 капли в «колодцы» пастеровской пипеткой. Засеянные чашки помещают в термостат при 36±1°С, результаты учитывают через 1,2 и 5 ч. При наличии термостабильной нуклеазы вокруг «колодцев» появляется ярко-розовая зона на синем фоне среды.

При окончательном анализе результатов бактериологического исследования на определенный вид (семейство, род) по ГОСТ 26670–91 надо учитывать следующее. Если при подтверждении характерных колоний обнаружено, что не менее 80% (т.е. не менее 4 из 5) из них принадлежат к S.aureus, то считают, что все характерные колонии, выросшие на чашках Петри, принадлежат к выявленным микроорганизмам. В остальных случаях количество выявляемых микроорганизмов определяют, исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных, взятых для подтверждения. Если при подтверждении колоний, полученных при пересеве с жидкой питательной среды, хотя бы в одной из 5 пробирок обнаружены выявляемые микроорганизмы, то такие пробирки с посевами считают положительными.

При определении общей бактериальной обсемененности продукта подсчитывают колонии в посевах на чашках Петри, где их выросло от 15 до 300, и вычисляют среднее арифметическое значение числа колоний во всех посевах одного разведения.

Если число колоний составляет от 15 до 300 в посевах не одного, а двух следующих друг за другом разведений, то вычисляют среднее арифметическое количество микроорганизмов по каждому из них отдельно. Если полученные результаты отличаются друг от друга более чем в 2 раза, то оценку проводят по результатам посева наибольшего разведения.

Если в одном из параллельных посевов одного разведения число колоний превышает 300, эти результаты используют для подсчета среднеарифметического значения. При числе колоний в параллельных посевах меньше 15 допускается определять суммарное число колоний и результат использовать для дальнейших расчетов. При этом количество инокулята т будет равно суммарному его количеству в параллельных посевах.

Полученные среднеарифметические значения округляют:

до числа, кратного 5, если среднее арифметическое число микроорганизмов менее 100;

до числа, кратного 20, если среднее арифметическое число микроорганизмов более 100 и оканчивается цифрой 5;

до числа, кратного 10, если среднее арифметическое число микроорганизмов более 100 и не оканчивается цифрой 5.

Количество микроорганизмов в 1 г (1 см³) продукта

M=N/m*C

где N – степень разведения навески; т – количество инокулята, внесенное на чашку Петри, см³; С – округленное среднеарифметическое значение числа колоний.

Результат определения выражают числом от 1,0 до 9,9 • 10ⁿ.

Если среднеарифметическое значение числа колоний, выросших на чашках Петри в посевах одного разведения (или число подтвержденных колоний), меньше 15 (5), результаты выражают следующим образом: количество определяемых микроорганизмов в 1 г (см³) продукта меньше 15 (5), умноженное на N/т.

Допускается для приблизительного подсчета учитывать рост на чашках Петри, число колоний на которых меньше 15 (5). Доверительные интервалы для таких случаев указаны ниже.

Если рост микроорганизмов на чашках Петри отсутствует или при подтверждении микроорганизмы определенных семейств, родов или видов не обнаружены, то результат выражают как количество определяемых микроорганизмов в 1 г (1 см³) продукта меньше 1, умноженное на значение N/m.

Если среднеарифметическое значение числа колоний, выросших на чашках Петри, в посевах одного разведения превышает 300 (150), то результат выражают следующим образом: количество определяемых микроорганизмов в 1 г (1 см³) продукта больше 150 или 300, или 50, умноженное на значение К/т.

Результаты выявления микроорганизмов в определенной навеске (объеме или площади поверхности) выражают с указанием величины навески следующим образом: микроорганизмы обнаружены или микроорганизмы не обнаружены.

Наиболее вероятное число (НВЧ) стафилококков в 1 г (1 см³) продукта определяют по ГОСТ 26670–91, исходя из количества положительных проб (пробирок) с посевами, т.е. тех, в которых обнаружен рост. Для этого выбирают три самых высоких последовательных разведения, в первом из которых все три пробирки являются положительными, а в последнем (или последующем неоцениваемом) – отрицательными (например, 4, 2, 0 или 3, 2, 1, 0). Если после разведения, в котором все три пробирки были отрицательными, одна из пробирок большего (т.е. следующего за ним) разведения окажется положительной (например, 3, 2, 0, 1), то для определения НВЧ учитывают три наивысших разведения, начиная с того, в котором количество положительных пробирок было меньше трех (т.е. 2,0,1).

Категория 1 – наиболее часто встречаемые комбинации положительных проб (пробирок), которые могут быть получены в 95% случаев. Рассчитанное НВЧ отвечает действительному числу определяемых в продукте микроорганизмов в пределах точности метода.

Категория 2 – менее вероятные комбинации положительных проб (пробирок), встречаемые в 4% случаев. Рассчитанное НВЧ может отличаться от действительного разброса, превышающего данную точность метода, но приемлемого в практике.

Категория 3 или 0 – неприемлемые комбинации положительных проб (пробирок), вероятность получения которых для нормальных продуктов равна нулю для категории 0 либо маловероятна для категории 3.

Эти категории дают часто результаты, отличающиеся от действительного числа в разбросе, значительно превышающем точность метода, и поэтому для расчета НВЧ неприемлемы.

С увеличением числа анализируемых проб от одной и той же партии продукта точность НВЧ повышается на одну, иногда на две категории. Для определения НВЧ учитывают три наивысших разведения, начиная с того, в котором количество положительных проб (пробирок) было меньше трех (т.е. 2, 0, 1).

Если после наивысшего разведения с тремя положительными пробами (пробирками) было посеяно лишь одно большое разведение, в котором оказались положительными одна или две пробы, то НВЧ микроорганизмов записывают как «более чем», так как в более высоких разведениях некоторые пробы могли бы оказаться положительными. Например, если при посеве продукта число положительных проб соответствовало трехчлену 3, 3, 1 или 3, 3, 2, то НВЧ будет больше 460 или 1100.

Если все пробы (пробирки) посеянных разведений окажутся отрицательными (т.е. 0, 0, 0), то НВЧ микроорганизмов ниже числа, выявляемого посеянными разведениями (например, ниже чем 3 в 10 г.). Наоборот, если все пробы посеянных разведений окажутся положительными (т.е. 3, 3, 3), то НВЧ микроорганизмов будет выше его максимального значения, определяемого посеянными разведениями (например, выше чем 1100 в 1 г).

При необходимости определения конечного числа микроорганизмов исследование повторяют.

Если три 10-кратных разведения были более низкими (или более высокими) по сравнению с приведенными в табл. 26, то НВЧ микроорганизмов в пробе будет на столько разрядов ниже (или выше), на сколько разрядов ниже (или выше) разведения, которые применялись для подсчета. Например, 10 см³ основного разведения (или 1 см³ переразведенной пробы) представляют собой разведение на один разряд ниже, а 10 см³ неразведенной пробы – на два разряда ниже. Так, при комбинации 3, 2, 1 НВЧ составляет 150 микроорганизмов в 1 г (1 см³) в случае, если инокулированы по 1 см³ разведения 10^-1, 10-², 10-³. Если инокулированы разведения 10-², 10-³, 10-⁴, то найденное НВЧ равно 150 • 10 = 1500 микроорганизмов в 1 г (1 см³). Если инокулировано по 10 и 1 см³ неразведенного продукта и 1 см³ разведения 10^-1, то НВЧ равно 150: 100 = 1,5 в 1 г (1 см³), или 15 микроорганизмов в 10 г. (10 см³) продукта.

Из значений НВЧ учитывают те, которые отвечают наиболее вероятным комбинациям трехзначного числа категории 1. Если НВЧ, соответствующее комбинации трехзначного числа категории 1, не получено, то его определяют комбинациями трехзначного числа, соответствующего категории 2.

Окончательный результат определения НВЧ вычисляют по формуле

М=N/ т*C

и выражают числом от 1,0 до 9,9 • 10n. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

При определении НВЧ S. aureus результаты посевов на жидкие среды считают положительными, если при последующем пересеве на агаризованные селективно-диагностические среды и подтверждении характерных колоний, выросших на этих средах, хотя бы в одной из них будет обнаружен S. aureus НВЧ S. aureus в 1 г (1 см³) продукта подсчитывают по количеству положительных посевов, как указано выше. При выявлении S. aureus в определенной навеске продукта посевы считают положительными (т.е. S. aureus выявлен в анализируемой навеске продукта), если при последующем пересеве на агаризованные селективно-диагностические среды и подтверждении характерных колоний, выросших на этих средах, хотя бы в одной из них будет обнаружен S. aureus.

Результаты посевов на агаризованные селективно-диагностические среды: при выявлении S. aureus в определенной навеске продукта посевы считают положительными, если при подтверждении характерных колоний хотя бы в одной будет обнаружен S. aureus; при определении количества S. aureus в 1 г (1 см³) продукта подсчет числа характерных колоний подлежит корректировке в зависимости от результатов подтверждения принадлежности этих колоний к S. aureus.

Если при подтверждении характерных колоний в 80% случаев (не менее чем в 4 из 5) подтвержден рост S. aureus, то считают, что все характерные колонии принадлежат к S. aureus. В остальных случаях количество характерных колоний, принадлежащих к S. aureus, определяют, исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему числу характерных колоний, взятых для подтверждения.

Результаты определения количества S. aureus в 1 г (1 см³) продукта и выявления его в определенной навеске продукта записывают по ГОСТ 26670–91 от 1 до 9,9 • 10ⁿ.

Профилактика пищевых отравлений должна основываться на следующих общих положениях:

1. предупреждать обсеменение продуктов микроорганизмами;

2. предупреждать размножение микробов в продуктах (соблюдать температурные режимы и сроки хранения);

3. уничтожать микробов в продукте тепловой обработкой.

Источником обсеменения пищевых продуктов патогенными стафилококками могут быть люди с гнойничковыми поражениями кожи, имеющие контакт с продуктами питания, а также больные ангиной. Кроме того, представляет опасность молоко, полученное от коров, больных маститом.

Профилактика пищевых интоксикаций стафилококковой этиологии сводится к предотвращению обсеменения продуктов патогенными стафилококками, размножению их, а также к уничтожению возбудителя в продуктах питания. К работе на пищевых предприятиях нельзя допускать людей, больных ангиной и с гнойничковыми заболеваниями (фурункулы, абсцессы, нагноившиеся раны, царапины). Необходимо строго соблюдать технологические режимы тепловой обработки продуктов и сроки хранения готовой продукции.

Нельзя допускать нарушений сроков реализации товара.

Список литературы

Корнелаева Р.П., Степаненко П.П., Павлова Е.В., Санитарная микробиология сырья и продуктов животного происхождения. - М.: 2006.–407 с.

Билетова Н.В., Корнелаева Р.П., Кострикина Л.Г. и др. Под ред. Любашенкои С.Я. Санитарная микробиология. - М.: Пищевая пром-сть, 1980. – 352 с.

Степаненко П.П. Микробиология молока и молочных продуктов. - М.: Лира, 2002. – 413 с.

Загаевский И.С. Жмурко Т.В. «Ветеринарно-санитарная экспертиза с основами технологии переработки продуктов животноводства». М.: Колос. 1983.

Макаров В.А. и др. «Ветеринарно-санитарная экспертиза с основами технологии и стандартизации продуктов животноводства». М.: Агропромиздат. 1991.

Королева Н.С., Семенихина В.Ф. Санитарная микробиология молока и молочных продуктов. – М.: Пищевая промышленность, 1980. - 256 с.

Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов. Санитарные правила и нормы (САНПиН 2.3.2.560–96). – М., 1997.

М.А. Сидоров, Р.П. Корнелаева «Микробиология мяса и мясопродуктов» 3-е издание. Москва «Колос» 1998–134 стр.