Рекомбинация и генетический анализ бактериофагов

Министерство сельского хозяйства РФ

ФГОУ ВПО

Оренбургский государственный аграрный университет

Кафедра микробиологии

Реферат

по генетике микроорганизмов на тему:

Рекомбинация и генетический анализ у бактериофагов

Выполнил: студент ΙV курса

ФВМ и Б специальности

«Микробиология» Акжигитов А.С.

Проверил: преподаватель кафедры

микробиологии Капустина О.А.

Оренбург 2010

Содержание

Введение

Рекомбинация у бактериофагов

Генетический анализ бактериофагов

Заключение

Список литературы

Введение

В основе наследственной изменчивости бактериофагов помимо мутации лежит рекомбинация. Рекомбинация у бактериофагов – это физическое взаимодействие геномов в смешанно-инфицированных клетках. При этом происходит обмен генетическим материалом или его частью между двумя (часто близкими) отличающимися по наследственным свойствам вирусами. Рекомбинация между родительскими геномами приводит к возникновению новых сочетаний генов в дочерних геномах, т. е. формированию нового генома. Рекомбинация путем включения одной молекулы ДНК в другую происходит между вирусной ДНК и ДНК клетки-хозяина. На этом основан метод искусственной рекомбинации молекул ДНК

В последнее десятилетие ДНК-вирусы человека и животных стали привлекать внимание генетиков как модель для изучения рекомбинации в клетках животных, особенно в связи с деталями механизма разрыв – воссоединение. В силу известной гетерогенности вирусных популяций в процессе их размножения в клетках могут создаваться условия не только для генетических, но и негенетических взаимодействий. Последние вызывают большое разнообразие фенотипических изменений, которое, маскируя истинный генотип вируса, влияет на результаты генетических исследований. Поэтому негенетические взаимодействия вирусов традиционно включаются в раздел анализа изменчивости вирусов в результате их взаимодействия друг с другом. Негенетические взаимодействия описаны у широкого круга вирусов и могут происходить между гетерогенными их группами и даже между РНК- и ДНК-содержащими.

1. Рекомбинация у бактериофагов

При взаимодействии бактериофагов друг с другом наследуемые изменения возникают в основном как результат истинных рекомбинаций. У вирусов животных и человека в зависимости от физической организации генома рекомбинация осуществляется двумя механизмами. Бактериофаги, геном которых представлен линейной молекулой ДНК или РНК, используют механизм интрамолекулярной рекомбинации, известный как механизм «разрыв — воссоединение». Бактериофаги с сегментированным геномом (ортомиксовирусы, реовирусы, буньявирусы, аренавирусы) используют механизм случайной пересортировки сегментов (генов) без разрыва ковалентных связей.

Механизм «разрыв — воссоединение» впервые сформулирован А. Херши в связи с анализом потомства смешанного заражения h-и r-мутантами фага Т2. Обнаружив, что в этом потомстве кроме частиц двух родительских типов присутствуют частицы h+r+ и hr, он предположил, что геном бактериофага состоит из расположенных в линейном порядке генов, каждый из которых несет генетическую информацию о каком-либо признаке вируса. При смешанном заражении бактериальной клетки два «сосуществующих» фаговых генома могут обмениваться между собой гомологичными участками в результате разрыва двух линейных структур в точно соответствующих точках между генами, определяющими г+- и h+-признаки, и последующего перекрестного воссоединения фрагментов. Такой перекрест или кроссинговер генетического материала может происходить в любой точке двух различных генетических структур.

Гипотеза «разрыв — воссоединение» была подтверждена позже на опытах по смешанному заражению меченым фагом. R. Holliday, Н. Potter, D. Dressier предложили универсальную модель одно- и двухцепочечного обмена между двумя линейными молекулами (рис. 1), согласно которой рекомбинация — такой же многоэтапный процесс, как и мутация. Она начинается с разрыва цепей ДНК каждого партнера с помощью нуклеаз, на этом месте происходят перекрещивание цепей и сшивание концов, затем точки скрещивания перемещаются за счет расплетения и сплетения спиралей и вращаются вокруг точки пересечения, создавая при этом симметрическую структуру — «хи»-интермедиат. В зависимости от того, на какую ось интермедиата (вертикальную или горизонтальную) действуют нуклеазы, образуемый после разделения и сшивания рекомбинант будет гетерозиготным либо по одной, либо по двум цепям.

Из ДНК-вирусов с линейной молекулой генома рекомбинационный процесс хорошо изучен герпес- и аденовирусов, которые рекомбинируют как с близкородственными, так и неродственными вирусами.

Генетическая рекомбинация между аденовирусами человека происходит с высокой частотой при продуктивной инфекции культур клеток. Причем рекомбинация наблюдается внутри одного серотипа или между близкородственными серотипами одной подгруппы, что связывают с отсутствием гомологичных последовательностей в геномах вирусов разных подгрупп, хотя общая их организация сходна. Было опрделено, что на рестрикционной карте ts+-peкомбинантов Ad5 и Ad2 предполагаемые сайты находятся в фрагменте размером около 20 п. н., занимающем участок соединения С-конца гена PV1 и N-конца гексонового гена. Сравнительное секвенирование аналогичных фрагментов трех независимых скрещиваний выявило, что в каждом случае непосредственное участие в рекомбинационном процессе принимала лишь небольшая его часть (от 45 до 156 п. н. в длину), соответствующая участкам полной гомологии ДНК.

Герпесвирусы занимают более выгодное положение: ДНК разных серотипов способны в одинаковой степени трансфицировать культуры клеток, имеют значительные участки гомологии и рекомбинируют с большой частотой. Создавались как межтиповые, так и внутритиповые рекомбинанты, с помощью которых картировались генные функции, контролирующие репликацию вируса, морфологию бляшек, резистентность к антивирусным лекарствам. R. Thompson котрансфекцией ДНК одного штамма с разными рестрикционными фрагментами другого получили рекомбинант, позволивший локализовать функцию повышения нейровирулентности.

Метод получения межтиповых рекомбинантов полиовирусов разработан V. Agol с сотрудниками на основе коинфицирования клеток gs-мутантом одного серотипа и gr-мутантом другого с последующей селекцией gr-клона из урожая двойной инфекции. Таким способом получена серия межтиповых рекомбинантов, сайты скрещивания которых были локализованы в центральной части генома между локусом антигенной специфичности (5'-сторона) и чувствительностью к гуанидину (3'-сторона). Определены первичные структуры скрещиваемых регионов, длина которых варьирует между 2 и 32 нуклеотидами. Сайты скрещивания оказались распределенными по геному неравномерно. Так, внутри гена полипептида 2А обнаружен только один такой участок, в то время как в других регионах выявлялись явные их скопления, что указывало на существование предпочтительных сайтов для рекомбинации.

Используя тот же принцип, V. Agol е. а. (1984) получали внутритиповые рекомбинанты между аттенуированным и нейровирулентным штаммами полиовирусов, изменения нейровирулентности которых определили интрацеребральным заражением обезьян. Показано, что рекомбинанты, унаследовавшие 5'-половину генома от вирулентного родителя, проявили нейровирулентный фенотип независимо от происхождения 3'-половины, а рекомбинанты с 5'-геномной половины от аттенуированного родителя имели аттенуированный фенотип. Следовательно, большие детерминанты нейровирулентности находятся на 5'-половине генома, а на 3'-половине — минорные или модулирующие детерминанты.

Таким образом, детальный анализ межтиповых и внутритиповых рекомбинантов полиовирусов представил окончательные доказательства истинности рекомбинации, опроверг случайность процесса, показал, что скрещивания происходят в определенных, хотя и многих сайтах.

Интромолекулярная рекомбинация зафиксирована и у вируса гриппа. Были обнаружены последовательности сегментов ДИ РНК, составленные из последовательностей от двух нормальных геномных сегментов.

Кроме того, К. Shimizu е. а. представили доказательства существования внутрисегментной комплементации между ts-мутантами вируса гриппа. По их данным, 83 ts-мутанта образовывали 13 комплементационных групп и 8 рекомбинационных. При этом четыре рекомбинационные группы включали вирусы, представляющие более чем одну комплементационную группу, а группа Н – в каждом комплементационном члене имела по четыре ts-локуса. Мутации с внутрисегментной комплементацией обнаружены в большинстве генов (РЗ, PI, P2, NA, NP и NS).

Относительно механизма внутрисегментной комплементации высказывались различные гипотезы. Считалось, что она проявляется: 1) если сегмент полицистронен (известно, что два сегмента (7, 8) генома вируса гриппа А кодируют по два белка Ml, M2 и NS1, NS2, но, внутрисегментная комплементация отмечена и при мутациях в генах, содержащих информацию для единственных белков) ; 2) если множественный белок состоит из смеси аллельных белковых субъединиц, кодируемых двумя комплементарными родительскими генами; 3) если родительские комплементарные вирусы несут мутации в генах, кодирующих белки с несколькими функциональными доминантами.

Много неясного остается и в другом механизме рекомбинации вирусов человека и животных — реассортименте. У вирусов с сегментированным геномом каждый сегмент — это независимая и самостоятельная молекула. Полагают, что в зараженных клетках существует активный механизм, регулирующий, чтобы каждый вирион получил из клеточного пула по одной копии всех сегментов. Можно предполагать, что перекомбинация генов осуществляется на стадии морфогенеза вирусов и этот процесс также зависит от клеточных факторов. К тому же выявить участие в этом процессе вирионных белков или каких-либо последовательностей нуклеотидов, способствующих ему, не удалось.

Из вирусов с сегментированным геномом рекомбинационный процесс наиболее детально изучен у ортомиксовирусов и реовирусов. Исследования на ортомиксовирусах начаты F. Burnet (1960) еще задолго до установления сегментированности их генома. Он получил ряд основополагающих данных, вплоть до предсказания структуры генома. В этих опытах потомство смешанной инфекции двумя штаммами, один из которых (WSN) был нейротропным, оказалось способным вызывать смертельную инфекцию при заражение мышей в мозг, но имело серологическую характеристику пневмотропного MEL штамма. При прямой и обратной рекомбинации этих штаммов, различающихся по семи признакам, обмен происходит как бы по двум сцепленным признакам. Одну группу сцепления составляли признаки, определяющие серологическую специфичность, термостабильность гемагглютининов, отношение к ингибирующему действию муцина овцы и патогенность для мышей при интраназальном заражении. Другая группа включала отношение к ингибирующему действию овомуцина, патогенность для куриных эмбрионов и нейропатогенность для мышей.

G. Hirst высказывал предположение, что вирусы гриппа могут скрещиваться по двум механизмам: 1) обмен полноценными сегментами с высокой частотой рекомбинации; 2) кроссинговер гомологичными сегментами с низкой частотой рекомбинации. Теперь имеется множество прямых доказательств способности вируса гриппа использовать при рекомбинации как интрамолекулярный механизм, так и перекомбинирование генов. Они основаны на сравнительном изучении электрофоретической подвижности сегментов генома и его продуктов, а также на их секвенировании.

Впервые антигенные гибриды из вируса разного серотипа выделены в лабораториях М. И. Соколова и Е. Kilbourne. Все рекомбинанты оказались асимметрическими в «антигенной реактивности», т. е. проявляли большую антигенность, унаследованную от одного из родительских штаммов. Независимо от этих исследований В. Tumova, N. Pereira представили доказательства рекомбинации между вирусами гриппа человека А2 и птиц АО. Двойная антигенность потомства устанавливалась в вирусспецифической реакции связывания комплемента. Р. Вебстер получил антигенные гибриды при смешанном заражении куриных эмбрионов различными штаммами вирусов гриппа А млекопитающих и птиц. Поверхностные антигены этих вирусов состояли из нейраминидазы одного родительского штамма и гемагглютинина другого.

Лабораторные доказательства антигенной гибридизации среди разных подтипов вирусов гриппа А послужили основой гипотетических механизмов, объясняющих антигенную лабильность и потенциал чрезвычайной изменчивости этого агента.

Рекомбинация неповрежденных участков генетического материала лежит в основе и другого генетического взаимодействия — множественной реактивации, заключающейся в формировании полноценного вируса за счет взаимного обмена активными участками генома. Таким образом, если кроссреактивация включает «ремонт» нарушений или неадекватности генома генетическим вкладом от инфекционного вируса, то множественная реактивация подразумевает взаимную помощь или «кооперацию» двух пораженных геномов без участия инфекционного вируса. Эти типы реактивации показаны в разных вирусных системах и наблюдаются между близкородственными вирусами и разными штаммами одного и того же вируса, между вирусами разных серотипов и неродственными вирусами, например Adl2 и ОВ-40. Примером межтиповой множественной рекомбинации служит результат опыта с облученными реовирусами млекопитающих трех серотипов. В основе феномена, скорее, лежит обмен неповрежденными сегментами генома, а не внутримолекулярная рекомбинация, причем перераспределение сегментов геномов разных серотипов может быть источником антигенных вариантов. А ts-мутанты З серотипа реовируса млекопитающих и птичьи реовирусы не взаимодействовали в клетках L, что указывает на их генетические различия.

Рекомбинантные механизмы лежат в основе возникновения и гетерозигот. В классической генетике этим термином определяют организм, в диплоидном наборе хромосом которого содержатся два различных аллеля какого-либо гена. У большинства вирусов животных такого рода гетерозиготность не наблюдается, поскольку их геномы гаплоидны. Гетерозиготными по всем маркерам могут быть ретровирусы, содержащие две копии геномной РНК. Гетерозиготность ретровирусов связывают с рекомбинационным процессом. У некоторых ДНК-вирусов (например, герпеса), имеются повторяющиеся последовательности и эти вирусы частично диплоидны. В этих диплоидных локусах также может возникать гетерозиготность. Так, выделено несколько типов рекомбинантов при скрещивании вирусов герпеса типа 1 и 2, которые содержали гетерозиготные терминальные повторяющиеся последовательности.

2. Генетический анализ бактериофагов

Генетика бактериофагов связана с генетическими особенностями бактерий-хозяев. Признаки бактериофагов, доступные генетическому анализу — это прежде всего скорость и полнота лизиса инфицированных клеток и круг бактерий-хозяев, поражаемых фагами. Широкое распространение в генетическом анализе бактериофагов получили мутанты с условным проявлением. Это мутанты, чувствительные к повышению и понижению температуры, — так называемые термочувствительные (ts) и холодочувствительные (cs). Они нормально размножаются и лизируют клетки только при пермиссивной температуре (37°С). В качестве условных используют также мутанты, чувствительные к действию определенных супрессоров, находящихся в геноме бактерий. Это класс так называемых sus (от англ. suppressor sensitive) мутантов. Sus-мутанты можно получить практически по любому гену, кодирующему белок. Генетический анализ бактериофагов основан на совместном заражении клетки генетически различающимися частицами бактериофага. Полные фаговые геномы, проникая в клетку, экспрессируют заложенную в них информацию подобно гомологичным хромосомам, и таким образом становится возможным исследование взаимодействия аллелей и неаллельных генов. Если два температурочувствительных мутанта, проникших в бактериальную клетку, несут изменения, способные взаимодействовать комплементарно, то в непермиссивных условиях клетки лизируются. В ходе репликации геномов возможна рекомбинация, в результате чего появятся рекомбинанты дикого типа. Их можно учесть, высевая фаговое потомство на чувствительные бактерии в условиях непермиссивных для родительских бактериофаговГенетический анализ бактериофагов сопряжен с рядом трудностей, определяемых особенностями их развития в клетке. Репликация геномов Т-четных фагов идет экспоненциально со временем генерации 2—3 мин. Вплоть до образования количества фаговой ДНК, эквивалентного 50 полным геномам, зрелые частицы фага в клетке не обнаруживаются. Затем из общего фонда синтезируемой ДНК фаговые геномы начинают расходоваться на образование зрелых частиц. При лизисе клетки в ней остается еще столько же ДНК, сколько включилось в головки фагов. В процессе репликации фаговые геномы претерпевают неоднократные циклы спаривания, рекомбинации и репликации. В результате наблюдаемая частота рекомбинации всегда выше ожидаемой. В подобных многократных циклах репликации фаговых геномов генетические события должны быть проанализированы с позиций популяционной генетики. Такой подход разработали Н. Висконти и М. Дельбрюк. При этом они исходили из следующих основных положений: 1) в общем фонде ДНК родительские геномы фагов полностью перемешаны; 2) каждый геном фага аналогичен целой хромосоме; 3) при репликации происходят неоднократные спаривания и рекомбинации. В соответствии с этими допущениями получается, что геномы Т-четных бактериофагов проходят около 5 циклов спаривания и рекомбинации. Однако вызывает сомнение универсальность и надежность исходных допущений. Так, множественность инфекции одной клетки (соотношение родительских частиц) может колебаться до 10 раз. Лизис индивидуальных зараженных клеток обнаруживает неравенство реципрокных классов рекомбинантов. Тем не менее все эти трудности преодолимы, если жестко контролировать соотношение вводимых в клетку геномов фага и время репликации и рекомбинации. При этом можно применять стандартную логику анализа рекомбинации в двух- и трехмаркерных скрещиваниях. На основе этого подхода построены генетические карты бактериофагов ф XI74, ф 80, X, которые представляют собой кольцо, соответствующее кольцевой структуре генома этих бактериофагов. Благодаря знанию генетики двух близких умеренных бактериофагов Я и ф 80 удалось получить их гибриды, совмещающие свойства как X, так и ф 80. Кольцевая карта рекомбинации построена и для Т-четного фага Т4, у которого геном в действительности представлен линейной молекулой ДНК. Этот парадокс объясняется тем, что геномы Т4, упакованные в частицы фага, имеют так называемую концевую избыточность, что допускает кольцевые перестановки, или кольцевые пермутации генов. Дело в том, что в головке Т4 заключено ДНК примерно на 1 % больше, чем соответствует одному геному фага. Дополнительные, концевые, участки фаговой ДНК и составляют физическую основу концевой избыточности. При заражении клетки между молекулами такой ДНК происходят рекомбинации с объединением нескольких геномов в конкатемеры. Длинные молекулы ДНК, состоящие из нескольких геномов, далее реплицируются и рекомбинируют вновь. При созревании бактериофага Т4 работает принцип «наполнения головки». При этом нарезаются молекулы ДНК, в которых наблюдаются концевая избыточность и кольцевые пермутации генов. В молекулах ДНК, полученных из разных источников, встречаются модифицированные основания, например, 5-метилцитозин, 6-метиламинопурин и др. Они не включаются в ДНК при репликации как таковые, а появляются в результате ферментативной модификации синтезируемых молекул, начиная со стадии фрагментов Оказаки. При этом модифицируются основания, занимающие определенное положение в молекуле. Эти реакции осуществляют ферменты, представляющие собой часть единой системы рестрикции — модификации. Модификация определенных оснований предохраняет ДНК от разрушения рестриктирующими эндонуклеазами, которые имеют сродство к тем же последовательностям нуклеотидов, что и ферменты модификации. Ферменты модификации защищают ДНК хозяина от действия эндонуклеаз рестрикции. При этом одна и та же молекула может претерпевать разные типы модификации ДНК. Методом центрифугирования в градиенте плотности в лизатах таких клеток можно обнаружить частицы бактериофага, несущие одну из родительских цепей ДНК и совмещающие типы модификации, характерные для штамма К и для штамма В. Структура многих сайтов рестрикции — модификации в настоящее время расшифрована. Эти сайты представлены короткими нуклеотидными последовательностями, характерная черта которых — их симметричность. Система рестрикции — модификации — это своеобразный барьер, охраняющий клетку от включения в ее генетический материал чужеродных молекул ДНК. Возникновение мутантов, лишенных способности к рестрикции, открывает дополнительные возможности для изменчивости за счет ассимиляции клеткой чужеродной генетической информации. Кроме того, некоторые рестриктазы (например, Eco RI) могут осуществлять сайтспецифическую рекомбинацию плазмид в клетках Е. coli. Успехи генетического анализа у микроорганизмов, особенно у бактерий и бактериофагов, сыграли революционизирующую роль в методах изучения структуры и функций генетического материала. Организация геномов бактерий и пути, ведущие к их рекомбинации, оказались, на первый взгляд, совершенно отличными от того, к чему привыкли генетики, работавшие с эукариотами. У бактерий были открыты дополнительные (к хромосоме) генетические элементы: плазмиды и эписомы. Некоторые эписомы существуют в свободной форме. Это бактериофаги, вся структура которых приспособлена к переносу генома между клетками. Другие плазмиды способны только к репликации в бактериальной клетке. Между этими крайними формами есть промежуточные варианты. Само существование таких дополнительных элементов генома поставило вопрос о возможности их использования для переноса генетического материала и не только между клетками бактерий.

Заключение

Перспективы практического применения рекомбинационной изменчивости во многом связаны с получением живых рекомбинантных вакцин. Весьма актуальным считается получение рекомбинантных вакцин против гриппа, возбудитель которого отличается большой изменчивостью. Принцип рекомбинации современных эпидемических вирусов с хорошо изученным донором аттенуации обеспечивает быстроту формирования клонов с такими полезными свойствами, как термочувствительность и безвредность при сохранении иммунизирующей способности эпидемических штаммов.

Но основании всех вышеперечисленных сведений можно сделать вывод, что генетическая рекомбинация является наиболее удобным методом преобразования биологических свойств вирусов, в частности бактериофагов. Но в настоящее время рекомбинация с успехом используется лишь для передачи признака ослабленной патогенности. На этом основано новое направление применения ts-мутантов для конструирования живых вакцин. Закономерности же передачи и наследования других «полезных» свойств изучены еще недостаточно. Существуют неоднократные указания на большие затруднения в использовании рекомбинации для быстрого выведения высокоурожайных штаммов, пригодных для производства гриппозных вакцин и вирусных диагностикумов. Пока нет какой-либо коллекции мутантов, несущих признак высокой репродуктивной активности.

Список литературы

Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика / Ф. Айала, Дж. Кайгер.- М.: Мир, 1987.- 368 с.

Бил Д., Ноулз Д. Внеядерная наследственность / Д. Бил, Д. Ноулз.- М.: Мир,1981.- 138 с.

Захаров И.А. Курс генетики микроорганизмов / И.А. Захаров.- Минск: Высшая школа, 1978.- 192 с..

Крылов В.Н. Геном бактериофагов / В.Н. Крылов.- М.: Наука, 1989.- 317 с.

Хейс У. Генетика бактерий и бактериофагов / У. Хейс. - М.: Наука, 1965.- 254 с.