Фотосинтетический кислород: роль H2O2

Фотосинтетический кислород: роль H>2>O>2>


По современным представлениям фотосинтетический кислород выделяется из воды. Имеется ряд соединений, аналогов H>2>O, взаимодействующих с водоокисляющим комплексом. Среди них особый интерес представляет пероксид водорода в связи с его возможным участием в фотосинтетическом выделении O>2>. Существуют предположения об H>2>O>2> как промежуточном продукте окисления H>2>O и даже как об исходном субстрате-доноре электронов. У некоторых цианобактерий и водорослей выделение O>2> прекращается в анаэробных условиях. Исследования роли H>2>O>2>в фотосинтетическом выделении O>2> представляются перспективными.

According to current views, the photosynthetic oxygen is evolved from the water. There is a number of compounds, of the H>2>O analogues, interacting with the water-oxidizing complex. Among these compounds, of particular interest is hydrogen peroxide as a possible participant in photosynthetic O>2> evolution. There are the assumptions of H>2>O>2> as an intermediate in H>2>O oxidation and, moreover, as the starting electron donor sub>strate. In several cyanobacteria and algae, O>2> evolution in the light is ceased under the anaerobic conditions. The elucidation of the H>2>O>2> role looks promising for the studies on photosynthetic O>2> evolution.

Фундаментальная проблема биохимии - механизм фотосинтетического выделения кислорода. Проблема не нова, возникла со времен Джозефа Пристли, открывшего в 1771 г. фотосинтетический кислород. Важность ее решения трудно переоценить: космическая роль зеленого листа по К.А.Тимирязеву заключается в фотосинтезе органических веществ и молекулярного кислорода - субстратов, обеспечивающих жизнедеятельность хемотрофных организмов. Проблема фотосинтетического кислорода имеет комплексный характер, исследования ведутся во многих лабораториях мира. В последние годы в решении проблемы наметился определенный прогресс. Наряду с фундаментальностью, проблема имеет и прикладную перспективу, в частности, ее решение позволило бы использовать принципы фотосинтетического механизма для получения из воды молекулярного водорода в качестве энергоносителя.

По современным представлениям фотосинтетический кислород выделяется из воды [1]. Фотосистема (ФС) II хлоропластов и цианобактерий функционирует как H3O:пластохинон-оксидоредуктаза [2]:

H>2>O → (Mn)>4> → Y>Z> → P680 → Фео → Q>A> → Q>B> Q>P> → Q>Z> (b>6>f),

где (Mn)>4> - четырехъядерный Mn-кластер водоокисляющего комплекса (ВОК), Y>Z> - остаток тирозина-161 в полипептиде D1 фотосистемы II, P680 - реакционный центр ФСII, Фео - промежуточный акцептор электронов (феофитин), Q>A> и Q>B> - первичный и вторичный пластохиноны, Q>P> - мембранный фонд пластохинона, Q>Z> - участок связывания пластохинона в b>6>f-цитохромном комплексе.

Окисление H>2>O включает четыре одноэлектронные стадии, приводящие к последовательному накоплению окислительных эквивалентов в Mn-кластере. Соответственно, Mn-кластер может находиться в пяти различных окислительно-восстановительных состояниях, обозначаемых символами S>0>-S>4>. Состояния S>0> и S>1>стабильны в темноте, S>4> превращается в S>0> сопряженно с выделением O>2>, состояния S>2> и S>3> не устойчивы и релаксируют в темноте в состояние S>1> за десятки секунд. В темноте соотношение S>1> : S>0> составляет 3-4, поэтому в условиях импульсного освещения, когда каждая световая вспышка вызывает один оборот P680, максимальный выход O>2> из H>2>O наблюдается в ответ на третий импульс; на первый импульс O>2> не выделяется.

Данные структурных исследований позволяют предположить, что (Mn)>4> представляет собой димер из двух биядерных центров. Это согласуется с данными о функциональной неоднородности четырех Mn-центров (см. [3] и цитированную там литературу). Одна из (Mn)>2>-групп, (Mn-Mn)>ВОК>, образует каталитический центр ВОК; другая, (Mn-Mn)>C>, по-видимому, служит регулятором функциональной активности (Mn-Mn)>ВОК>. Существует ряд соединений, аналогов H>2>O, взаимодействующих с ВОК. Так, окисление NH>2>OH и NH>2>NH>2> ведет к образованию сверхвосстановленных состояний (Mn)>4>-кластера - состояний S>-1> и S>-2> [3]: протекают реакции S>1> → S>-1> и S>2> → S>-2>, которые в рамках представлений о биядерных (Mn)>2>-группах могут соответствовать переходам:

и

Особый интерес среди аналогов H>2>O представляет пероксид водорода. В присутствии H>2>O>2> хлоропласты выделяют O>2> в ответ на первый световой импульс [4]. Этот результат подтвержден в опытах с H>2>18O>2> [5]. В темноадаптированных тилакоидах хлоропластов H>2>O>2> вызывает переход S>1> → S>-1> [4, 5]. При этом устанавливается соотношение S>0> : S>-1>  : S>1>, близкое к 0 : 6 : 4 [5]. Состояние S>-1> стабильно и не релаксирует, по меньшей мере, в течение 15 мин [5]. Одиночный световой импульс вызывает переход S>-1>/S>1> → S>0>/S>2>, который инициирует темновую реакцию окисления H>2>O>2> с образованием O>2> [4,5]. Как продемонстрировано в опытах с H>2>18O>2>, весь O>2> выделяется из H>2>O>2> [5], в расчете на 1 P680 после одиночной вспышки света выделяется более 20 молекул O>2>. Эта реакция, подобная каталазной реакции, предположительно обусловлена восстановлением S>2> до S>0> посредством H>2>O>2> (E>0>' для O>2>/H>2>O>2> равен 0,295 В) и последующим H>2>O>2>-зависимым окислением S>0> до S>2> (E>0>' для H>2>O>2>/H>2>O равен 1,42 В). Реакции S-состояний, вызываемые H>2>O>2>, иллюстрирует схема (по [5]).

Переходы S>2> → S>1> и S>0> S>-1> приводят к постепенному затуханию темнового выделения O>2> из H>2>O.

Имеются данные о том, что выделение O>2> из H>2>O>2> в результате циклического перехода S>2> → S>0> → S>2> возможно без предварительного воздействия одиночным световым импульсом [6-8]. Процесс зависит от (Mn)>4>, Ca2+ и Cl- [6]. Эти данные, однако, подвергнуты критике [9]. В частности, комплексы ФСII, лишенные субъединиц ВОК с молекулярной массой 17 и 24 кДа ( на которых проводились опыты [6-8]), по данным работы [10] при воздействии H>2>O>2> теряют Mn, а по данным работы [8] полностью сохраняют его и при этом характеризуются отсутствием шестиполосного сигнала ЭПР от Mn2+, находящегося в водном окружении. Утверждается [9], что такой сигнал в условиях комнатной температуры, в которых проводились измерения [8], должен регистрироваться и в образцах с нативным Mn-кластером ВОК. Тилакоидные мембраны, обедненные Cl-, не способны к фотоокислению H>2>O, но выделяют O>2> из H>2>O>2> на свету [11]. Опыты с антибиотиком A23187 (осуществляющим трансмембранный обмен двухвалентных катионов на 2H+) и данные о действии добавленного Mn2+ склонили авторов работы [11] к предположению о том, что фотоокисление H>2>O>2> в таких мембранах катализируется свободным или лабильно связанным Mn, возникающим в результате H>2>O>2>-зависимой деструкции (Mn)>4>, входящего в состав ВОК. Добавленный Mn2+ поддерживает окисление H>2>O>2> в тилакоидных мембранах, обогащенных ФСII и предварительно лишенных Mn [12].

Таким образом, к настоящему времени нет ясности по вопросу, нужен ли для выделения O>2> из H>2>O>2> интактный ВОК. Или этот процесс протекает и после деструкции ВОК? В этом случае пути окисления H>2>O и H>2>O>2> расходятся, и тогда изучение разложения H>2>O>2> в качестве подхода для познания механизма выделения O>2> из H>2>O теряет смысл.

Однако имеются данные, полученные с применением другого подхода. В определенных условиях электрон-донорная ветвь ФСII может генерировать H>2>O>2>. Образование H>2>O>2> на свету вызывают ADRY-реагенты (ADRY - от английского "Acceleration of Deactivation Reactions of the Water-Oxidizing Complex Y", см. [2] в качестве обзора) [13] - соединения, которые, окисляясь, ускоряют дезактивацию S>2>- и S>3>-состояний с образованием S>1>. H>2>O>2> образуется в вывернутых тилакоидных мембранах, если они лишены 16- и 23 кДа-полипептидов ВОК [14]. Процесс зависит от добавленного Mn2+ и подавляется ЭДТА. Освещение мембран, обогащенных ФСII в результате обработки детергентом, тоже приводит к образованию H>2>O>2> [15, 16], как предполагают авторы, в электрон-донорной ветви ФСII.

H>2>O>2>, образованный в электрон-донорной ветви ФСII, высвобождается лишь при кислотной обработке мембран - при снижении pH до 1,4 [15]. Связанный H>2>O>2> образуется на первую вспышку света, на последующие вспышки наблюдаются осцилляции с периодом в два такта: на нечетные вспышки H>2>O>2> образуется, а на четные - исчезает. Выход связанного H>2>O>2> составляет 0,35 моль на 1 моль P680. Связанный H>2>O>2> образуется и в мембранах, лишенных Mn, но без осцилляций на последовательные вспышки света [15].

Условием образования H>2>O>2> по данным работы [16] является помещение мембран в гипотоническую среду с низкой концентрацией сахарозы. Если в качестве акцептора электронов в реакции Хилла использовать 2,6-дихлорфенолиндофенол (ДФИФ), то количество фотовосстановленного ДФИФ в расчете на электронные эквиваленты более чем в 1,5 раза превышает количество выделенного O>2>. Разница стирается при добавлении каталазы [16]. Это свидетельствует о том, что значительная доля электронного транспорта через ФСII имеет результатом не выделение O>2>, а образование H>2>O>2> [16]. Предлагаются два возможных варианта объяснения полученных результатов [16]: образование H>2>O>2> как промежуточного продукта на пути окисления H>2>O до O>2> или как продукта, возникающего в результате замыкания цикла S-состояний (S>2>- или S>3>-состояния Mn-кластера релаксируют соответственно в S>0> или S>1> с высвобождением H>2>O>2>).

Таким образом, и этот подход не дает однозначных результатов относительно роли H>2>O>2> в фотоокислении H>2>O. Более того, при одноэлектронном восстановлении O>2> компонентами электрон-акцепторных ветвей ФСII и ФСI образуется O>2>-. (см. [17] и цитированную там литературу). В изолированных хроматофорах пурпурных бактерий окисляется вторичный хинон, наиболее вероятно, в форме семихинона [18, 19]. При обработке хроматофоров детергентами с O>2> взаимодействует бактериофеофитин [20]. В модельных системах кислородом окисляются фотовозбужденные хлорофилл а и бактериохлорофилл а [21, 22]. Комплексы ФСII обладают высокой активностью супероксиддисмутазы [17], катализирующей реакцию:

2O>2>-. + 2H+ → H>2>O>2> + O>2>.

Применение еще одного подхода, "эволюционного", к проблеме фотосинтетического кислорода представляется перспективным. Эволюционно творцами оксигенного фотосинтеза стали цианобактерии. Многие из них образуют на свету H>2>O>2> [23]. Перенос электронов на O>2> с последующим образованием H>2>O>2> у цианобактерии Microcoleus chtonoplastes достигает 40% общего потока электронов через ФСII [24]. Исследованная цианобактерия имеет высокую активность супероксиддисмутазы и не содержит каталазы [24].

В условиях импульсного освещения изолированные тилакоиды Oscillatoria chalybea выделяют O>2> в ответ на первую световую вспышку (см. [25] и цитированную там литературу). Такие же данные получены с представителями Synechocystis и Synechococcus. Масс-спектрометрический анализ показал, что освещение мембран O. chalybea в присутствии H>2>18O>2> или 18O>2> в газовой фазе приводит к выделению 18O>2>. Сделан вывод о том, что 18O>2>, добавленный в газовую фазу, растворяется в водной фазе, поглощается мембранами и превращается в компонент, который окисляется при освещении с выделением 18O>2>. Данные изотопного распределения (16O>2>, 16O18O, 18O>2>) показывают, что кислород выделяется не из H>2>18O, поскольку сигнал 16O18O, который неизбежно должен возникать при окислении воды, невелик. Следовательно, 18O>2> выделяется из H>2>18O>2>, образующегося в результате темнового поглощения 18O>2> из газовой фазы [25]. Фотоокисление воды у O. chalybea тоже происходит, но доля H>2>O в светозависимом выделении O>2> значительно ниже, чем доля H>2>O>2>. В анаэробных условиях выход O>2> на свету существенно снижается, при этом подавляется выделение O>2> из H>2>O>2>, но не из H>2>O [25]. Анаэробиоз ингибирует также фотовыделение O>2> зеленой водорослью Ulva sp. [26].

Таким образом, для фотосинтетического выделения O>2> указанными организмами требуется, чтобы в среде содержался O>2>, наиболее вероятно, как субстрат для образования H>2>O>2>. Предполагается, что H>2>O>2> является эволюционным предшественником H>2>O в качестве донора электронов для ФСII [25].

Более того, выдвинуто предположение [27], что в ходе современного фотосинтеза O>2> выделяется не из H>2>O, а из H>2>O>2> экзогенного и эндогенного (внутриклеточного) происхождения.

Процессы образования H>2>O>2> в атмосфере и природных водоемах, а также в клетках микроорганизмов подробно рассмотрены в обзоре [28]. Отметим лишь, что согласно расчетам [28] на каждый квадратный метр поверхности суши и океанов за год с осадками выпадает ~ 200 г H>2>O>2> [28], до 15% O>2>, потребляемого организмом животного, превращается в H>2>O>2> [29]. Генераторами H>2>O>2> в фотосинтезирующей клетке являются тилакоидные мембраны, митохондрии, пероксисомы, эндоплазматический ретикулум. Концентрация H>2>O>2> в водоемах в среднем составляет 10-6 М [28]. Для использования в фотосинтезе маловато. Поэтому предполагаются механизмы концентрирования H>2>O>2> в клетке, например, в результате транспирации [27]. Напомним, что концентрация CO>2> в воздухе тоже невелика - 0,03%.

Если H>2>O>2> принять в качестве эволюционного предшественника H3O как донора электронов при фотосинтезе, то для образования H>2>O>2> был необходим O>2>. Мог ли O>2> появиться в добиогенный период развития Земли? Кислород современной земной атмосферы на 2,3% тяжелее кислорода, образующегося фотосинтетически [30]. Следовательно, помимо фотосинтеза должен быть другой источник O>2>, поставляющий его в атмосферу. "...свободный кислород в газовой фазе появился на Земле в глубокой древности, т.е. в раннем докембрии, в результате дегазации базальтовой магмы, подобно тому как появились в атмосфере и другие газы. Более того, он продолжает поступать из земных недр до настоящего времени. Магма является тем первым мощным источником кислорода в природе, который определяет количество и качество его в атмосфере совместно с появившимся несколько позднее кислородом фотосинтетическим" ([30], стр. 10). Кислород современной атмосферы на 30% имеет фотосинтетическое и на 70% геологическое (из земных недр) происхождение [30]. По данным минералогии, как было отмечено В.Н.Вернадским [31], в пределах научно изученных геологических периодов состав воздуха не менялся.

Рассмотренные данные показывают, что H>2>O>2>, возможно, играет важную роль в системе фотосинтетического выделения O>2>, однако эти данные не поддаются однозначной интерпретации. H>2>O>2> - промежуточный продукт окисления H>2>O или исходный субстрат-донор электронов? Пока нельзя даже ответить на вопрос: H>2>O>2> - это хорошо или плохо для фотосинтеза? Имеются данные о пагубном действии H>2>O>2>. H>2>O>2>, образующийся как в электрон-донорной, так и в электрон-акцепторной ветви ФСII, вызывает фотоингибирование ВОК [32].

Таким образом, представление о воде как доноре электронов и источнике кислорода при фотосинтезе не является однозначным. В последние годы появились данные об участии H>2>O>2> в фотосинтетическом выделении O>2>. Исследования в этой области представляются перспективными.

Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (грантом 94-04-12227-а).

Список литературы

    Самуилов В.Д. (1993) Биохимия, 58,1481-1485.

    Самуилов В.Д., Киташов А.В. (1996) Биохимия, 61, 404-411.

    Messinger, J., and Renger, G. (1993) Biochemistry, 32, 9379-9386.

    Velthuys, B., and Kok, B. (1978) Biochim. Biophys. Acta, 502, 211-221.

    Mano, J., Takahashi, M., and Asada, K. (1987) Biochemistry, 26, 2495-2501.

    Frasch, W.D., and Mei, R. (1987) Biochim. Biophys. Acta, 891, 8-14.

    Frasch, W.D., and Mei, R. (1987) Biochemistry, 26, 7321- 7325.

    Frasch, W.D., Mei, R., and Sanders, M.A. (1988) Biochemistry, 27, 3715-3719.

    Debus, R.J. (1992) Biochim. Biophys. Acta, 1102, 269-352.

    Ghanotakis, D.F., Topper, J.N., and Yocum, C.F. (1984) Biochim. Biophys. Acta, 767, 524-531.

    Sandusky, P.O., and Yocum, C.F. (1988) Biochim. Biophys. Acta, 936, 149-156.

    Klimov, V.V., Allakhverdiev, S.I., Shuvalov, V.A., and Krasnovsky, A.A. (1982) FEBS Lett., 148, 307-312.

    Sayre, R.T., and Homann, P.H. (1979) Arch. Biochem. Biophys., 196, 525-533.

    Schroder, W.P., and Akerlund, H.-E. (1986) Biochim. Biophys. Acta, 848, 359-363.

    Ананьев Г.М., Климов В.В. (1988) Докл. АН СССР, 298, 1007-1011.

    Wydrzynski, T., Angstrom, J., and Vanngard, T. (1989) Biochim. Biophys. Acta, 973, 23-28.

    Ananyev, G., Renger, G., Wacker, H., and Klimov, V.V. (1994) Photosynth. Res., 41, 327-338.

    Remennikov, V.G., and Samuilov, V.D. (1979) Biochim. Biophys. Acta, 546, 220-235.

    Remennikov, V.G., and Samuilov, V.D. (1979) Arch. Microbiol., 123, 65-71.

    Ременников В.Г., Самуилов В.Д. (1980) Докл. АН СССР, 252, 491-494.

    Abdourashitova, F.D., Barsky, E.L., Gusev, M.V., Il'ina, M.D., Kotova, E.A., and Samuilov, V.D. (1984) Photobiochem. Photobiophys., 8, 133-142.

    Барский Е.Л., Камилова Ф.Д., Ременников В.Г., Самуи-лов В.Д. (1986) Биофизика , 31, 789-792.

    Stevens, S.E., Patterson, C.O.P., and Myers, J. (1973) J. Phycol., 9, 427-435.

    Дубинин А.В., Застрижная О.М., Гусев М.В. (1992) Микробиология, 61, 384-389.

    Bader, K.P. (1994) Biochim. Biophys. Acta, 1188, 213-219.

    Popovic, R., Swenson, S.I., Colbow, K., Vidaver, W.E., and Bruce, D. (1987) Photosynthetica, 21, 165-174.

    Комиссаров Г.Г. (1995) Хим. физика , 14, 20-28.

    Штамм Е.В., Пурмаль А.П., Скурлатов Ю.И. (1991) Успехи химии, 60, 2373-2411.

    Oshino, N., Jamieson, D., Sugano, T., and Chance, B. (1975) Biochem J., 146, 67-73.

    Бгатов В.И. (1985) История кислорода земной атмо-сферы. Недра, Москва.

    Вернадский В.Н. (1955) Избр. соч., Т. 2, Изд-во АН СССР, Москва, с. 448.

    Bradley, R.L., Long, K.M., and Frash, W.D. (1991) FEBS Lett., 286, 209-213.