Перспективы применения липосомальных форм

Оглавление

Введение

Глава 1. История открытия липосом

Глава 2. Применение липосом в медицине

2.1 Свойства липосомальных частиц

2.2 Использование липосом как транспортных частиц

2.3 Применение липосом в лечении вирусных заболеваний

2.4 Липосомы и противотуберкулезная терапия

2.5 Использование липосом в химиотерапии при онкозаболеваниях

2.6 Иммуносомы-разновидность липосом

Глава 3. Технология получения липосом

3.1 Структура липосомы

3.2 Механизм действия липосом

3.3 Технологии получения липосом

3.4 Гидрогель липосомные гибриды

Глава 4. Способы активизации липосом, как транспортных частиц

4.1 Липосомы, способные к триггерному выходу лекарства: Термо и рН- чуствительные липосомы

4.2 Комбинация липосом и ингибиторов мембранных транспортеров

4.3 Доставка аналогов гидрофобных лекарств

4.4 Использование липосомальных векторов в генной терапии

Глава 5. лекарственные препараты на основе липосом

5.1 Фосфоглив - оригинальный препарат российских технологий

5.2 Липосом-форте – препарат для применения в неврологической практике

5.3 Другие препараты,применяемые в медицине

5.4 Липосомы в дерматологии

Выводы

Литература

Введение

Перспективы развития фармацевтической технологии определяются требованиями современной фармакотерапии, которые предполагают создание максимально эффективных с лечебной точки зрения лекарственных препаратов при содержании в них минимума лекарственных субстанций, не обладающих побочными действиями. В основе решения этой задачи лежат положения и принципы биофармации, базирующиеся на оптимальном подборе состава и вида лекарственной формы и использовании оптимальных технологических процессов. Этим объясняется широкое распространение и углубление биофармацевтических исследований во многих странах.

Однако изучение биофармацевтических аспектов получения и назначения лекарственных препаратов, изучение "судьбы" лекарственных средств в организме — это лишь первый этап решения сформулированной выше задачи. Дальнейшие усилия должны быть направлены на реализацию полученных сведений в процессе производства и применения лекарственных препаратов с целью ликвидации таких их недостатков, как короткий срок действия; неравномерное поступление лекарственных веществ в патологический очаг; отсутствие избирательного действия; недостаточная стабильность и др.

Лишь те лекарства могут считаться рациональными, которые обеспечивают оптимальную биологическую доступность действующих веществ

К первоочередным задачам фармацевтической технологии следует отнести повышение растворимости труднорастворимых лекарственных веществ в воде и липидах; увеличение стабильности гомогенных и гетерогенных лекарственных систем; продление времени действия лекарственных препаратов; создание лекарств направленного действия с заданными фармакологическими свойствами.

Совершенствование регулируемости и направленности действия биологически активных веществ является основным направлением в развитии фармацевтической технологии. Разработанные лекарственные системы с регулируемым высвобождением действующих веществ позволяют быстро достичь лечебного эффекта, длительно удерживать постоянный уровень их терапевтической концентрации в плазме крови. Как показала практика, использование таких лекарственных систем дает возможность уменьшить курсовую дозу, устранить раздражающее действие и передозировку лекарственных веществ, уменьшить частоту проявлений побочных эффектов

Начиная с бронзового века, когда впервые был получен сплав меди и олова, люди используют сочетания различных материалов, чтобы усилить лучшие свойства каждого из них. Последним примером такого удачного сочетания является разработка учеными Национального института стандартов и технологий (National Institute of Standards and Technology – NIST), Университета Мэриленда (University of Maryland) и Управления контроля качества продуктов и лекарств США (U.S. Food and Drug Administration – FDA) метода сочетания свойств двух материалов, каждый из которых вызывает огромный интерес специалистов в области биомедицины: фосфолипидных пузырьков, называемых липосомами, и частиц гидрогеля – заполненных молекулами воды сетей полимерных цепочек. Их сочетание приводит к образованию гибридной наноразмерной частицы, которая, вполне вероятно, сможет достигать определенных, например опухолевых, клеток, легко проходить через их мембраны, а затем медленно выделять лекарственные вещества.

В недавней статье в журнале Langmuir ученые рассмотрели преимущества и недостатки липосом и наночастиц гидрогеля как средств адресной доставки лекарственных препаратов. Хотя липосомы обладают полезными поверхностными свойствами, что позволяет им ориентироваться на определенные клетки и проходить через их мембраны, они могут разрываться при изменении условий окружающей их микросреды. Наночастицы гидрогеля более стабильны и обладают свойствами контролируемого выделения лекарственных препаратов, что дает возможность осуществлять тонкую настройку дозировки лекарств с учетом времени, но подвержены разложению и собираются в конгломераты. Целью ученых являлось создание наночастиц, сочетающих оба компонента, что позволило бы использовать сильные стороны каждого из материалов, одновременно минимизировав слабые

Целью нашей работы явилось изучение литературных источников, описывающих современные поколения лекарств,в частности липосомальные препараты и современные способы ихих получения , изучение транспортных свойств липосом.

Глава 1. История открытия липосом

Липосомы – это микроскопические заполненные жидкостью сферические частицы, мембрана (оболочка) которых состоит из молекул тех же природных фосфолипидов, что и клеточные мембраны. Водорастворимые (гидрофильные) лекарственные вещества могут быть заключены во внутреннее водное пространство липосом, а жирорастворимые (гидрофобные) – в бислойную липидную мембрану. В последнее время липосомы находят все большее признание в мире как перспективные носители лекарственных веществ, поскольку согласно результатам многочисленных клинических испытаний лекарства, вводимые в составе липосом, более эффективны и менее токсичны, чем применяемые в свободном виде. Впервые на них обратил внимание английский исследователь Алек Бэнгхем (Bangham A.D.) с коллегами в 1965 году. Они заметили, что липосомы (это название утвердилось года три спустя) весьма напоминают мембраны клеток. В те годы уже было известно, что клеточные мембраны выполняют много функций, и липосомы сразу же стали важным инструментом для их изучения. В середине 60-х годов английский ученый Алек Бэнгхем, выясняя роль фосфолипидов в свертывании крови, изучал структуру дисперсий, образующихся при набухании фосфолипидов в избытке воды. На электронных микрофотографиях он увидел слоистые частицы, удивительно похожие на мембранные структуры клетки. Следующее исследование показало, что элементы, присутствующие в растворе в момент набухания фосфолипидов, включаются внутрь этих частиц и удерживаются там длительное время, обмениваясь с наружным раствором с очень малой скоростью. Так впервые было установлено, что фосфолипиды, являющиеся основными компонентами клеточных мембран, способны самопроизвольно образовывать в воде замкнутые оболочки. Эти оболочки захватывают в себя часть окружающего водного раствора, а образующая их фосфолипидная мембрана обладает свойствами полупроницаемого барьера, легко пропускающего воду, но препятствующего проникновению растворенных в ней веществ.

Как модели мембран, липосомы позволили исследовать ряд их свойств: электрическое сопротивление, проницаемость для молекул воды, для ионов и других заряженных частиц, а также для содержимого клеток. Липосомы используются, кроме того, для изучения действия на мембраны витаминов, гормонов, антибиотиков и других препаратов. Эта сторона дела привлекла наибольшее внимание исследователей, поскольку выяснилось, что липосомы хорошо справляются с ролью носителей лекарств.

Известно, что заболевания поражают не весь организм, а развиваются в отдельных органах и тканях. Так, например, при раке главные события происходят в месте расположения опухоли, при инфаркте миокарда – в мышце сердца, при дизентерии – в кишечнике. Поэтому и лечение пойдет быстрее и успешнее, если лекарства будут действовать непосредственно в очаге заболевания. Особенно это важно в тех случаях, когда приходится иметь дело с весьма ядовитыми препаратами, которые хорошо лечат саму болезнь, но при этом плохо влияют на другие системы организма. Часто это свойство некоторых лекарств заставляет отказываться от использования их и применять менее эффективные.

Однако создать нужную концентрацию лекарственных веществ в пораженных болезнью местах, не затрагивая остальные, – задача непростая. Ведь медикаменты, каким бы способом их ни вводили, расходятся по всему организму более или менее равномерно. А чтобы они попали в нужные места, сделали вывод медики, необходим какой-то носитель, который бы мог их туда доставить. За последнии несколько лет было предпринято много попыток для решения этой проблемы, перепробовано множество соединений, и оказалось, что лучшими носителями лекарств являются липосомы.

Свойства липосом и их поведение определяются прежде всего наличием у них замкнутой мембранной оболочки. Несмотря на молекулярную толщину (около 4 нм), липидный бислой (бимолекулярный липидный слой) отличается исключительной механической прочностью и гибкостью. Благодаря этому липосомы сохраняют целостность при различных повреждающих воздействиях, а их мембрана обладает способностью к самозалечиванию возникающих в ней структурных дефектов. Вместе с тем гибкость бислоя и его текучесть придают липосомам высокую пластичность.

Глава 2. Применение липосом в медицине

2.1 Свойства липосомальных частиц

Какие же качества липосом дают им преимущества перед другими носителями лекарств? Прежде всего, это сродство с природными мембранами клеток по химическому составу. Известно, что липиды, входящие в состав мембран, занимают от 20 до 80 процентов их массы. Поэтому при правильном подборе компонентов липосом их введение в организм не вызывает негативных реакций.

Второе важное свойство липосом – это универсальность. Благодаря полусинтетической природе можно широко варьировать их размеры, характеристики, состав поверхности. Это позволяет поручать липосомам переносить широкий круг фармакологически активных веществ: противоопухолевые и противомикробные препараты, гормоны, ферменты, вакцины, а также дополнительные источники энергии для клетки, генетический материал.

В-третьих, липосомы сравнительно легко разрушаются в организме, высвобождая доставленные вещества, но в пути следования липосомы, сами лишенные свойств антигена, надежно укрывают и свой груз от контакта с иммунной системой и, стало быть, не вызывают защитных и аллергических реакций организма.

Важную роль играет также характер взаимодействия липосом с клетками. Оно может принимать разные формы: самая простая – липосомы адсорбируются (прикрепляются) на клеточной поверхности. Дело может на этом закончиться, а может пойти дальше: липосому поглотит клетка (этот процесс «заглатывания» называется эндоцитоз), и вместе с ней внутрь клетки попадут те вещества, которые она доставила. Наконец, липосомы могут слиться с мембранами клеток и стать их частью. При этом могут изменяться свойства клеточных мембран: например, их вязкость и проницаемость, величина электрического заряда. Может также увеличиться или уменьшиться количество каналов, проходящих через мембраны. Таким образом, благодаря липосомам появляется новый способ направленного воздействия на клетку, который можно назвать «мембранной инженерией».

Формы взаимодействия липосом с мембраной клетки: липосома может увеличить проницаемость мембраны – вызвать образование дополнительных каналов (I); может прикрепиться к мембране – адсорбироваться (II); важная форма взаимодействия – поглощение липосомы клеткой, в этом случае вещество, принесенное липосомой, попадает непосредственно в клетку (III); иногда клеточная мембрана и липосома обмениваются липидами (IV), а в других случаях мембраны липосомы и клетки сливаются (V).

В зависимости от размера частиц и числа образующих их липидных слоев различают следующие липосомы:

1) малые моноламеллярные, образованные одиночным липидным бислоем (диаметр 20-50 нм);

2) крупные моноламеллярные, образованные также одиночным бислоем (диаметр 50-200 нм и выше);

3) многослойные (мультиламеллярные), насчитывающие до нескольких десятков и даже сотен липидных бислоем (диаметр до 5000-10000 нм)

Для приготовления липосомы обычно используют фосфолипиды. Многослойные липосомы легко образуются при встряхивании водной дисперсии набухшего липида. При этом получается взвесь липосомы с широким распределением частиц по размерам. Сравнительно гомогенную дисперсию липосомы можно получить, пропустив их через поликарбонатные фильтры с заданным размером пор. Расстояние между соседними липидными бислоями составляет 2-3 нм, но может возрастать до 20 нм и более в случае заряженных бислоев. На 1 моль липида многослойные липосомы содержат 1-4 литра воды. Они обладают свойствами идеального осмометра, (осмометр — (осмо + греч. metreo измерять) прибор для измерения осмотического давления или концентрации осмотически активных веществ) меняя свой объем в ответ на изменение концентрации веществ в окружающей водной среде. Малые моноламеллярные липосомы получают из многослойных при обработке их ультразвуком при впрыскивании спиртового раствора липидов в водную среду, продавливанием под большим давлением воднолипидных дисперсий через небольшое отверстие, а также удалением детергента, солюбилизирующего липид, диализом или гель-фильтрацией. Такие липосомы содержат 0,2-1,5 л воды на 1 моль липида. Малые моноламеллярные липосомы не обладают осмотической активностью и не коагулируют в течение длит. времени. Большие моноламеллярные липосомы имеют значит. внутренний объем воды (8-14 л на 1 моль липида) и обладают осмотической активностью. Обычно их получают удалением солюбилизирующего детергента в условиях контролируемого диализа или впрыскиванием раствора липида в легколетучем растворителе (диэтиловый эфир, петролейный эфир, пентан) в подогретую до 60 °С воду. Крупные однослойные липосомы могут быть также получены из малых липосом путем их слияния под действием Са2+ или в условиях термотропного фазового перехода. Получены также липосомы, образованные липидами (или подобными молекулами), которые способны полимеризоваться (содержат обычно связи С—С или ). Полимеризация может осуществляться как в гидрофобной, так и в гидрофильной области бислоя и приводить к, так называемым, полимерным липосомам. Последние отличаются от обычных липосом большей стабильностью. Липосомы широко используют в качестве модельных систем при изучении принципов молипосомы организации и механизмов функционирования биолипосомы мембран. Они пригодны для изучения пассивного транспорта ионов и малых молекул через липидный бислой. Изменяя состав липидов в липосомах, можно направленно менять свойства мембран. Включением мембранных белков в липидный бислой получают так называемые, протеолипосомы, которые используют для моделирования разнообразных ферментативных, транспортных и рецепторных функций клеточных мембран. Липосомы используют также в иммунологических исследованиях, вводя в них разлипосомы антигены или ковалентно присоединяя к липосомы антитела. Они представляют собой удобную модель для изучения действия на мембраны многих лекарственных средств и других биологически активных веществ. Во внутренний водный объем липосомы (в т. ч. полимерных) можно включать лекарства, пептиды, белки и нуклеиновые кислоты, что создает возможность практического применения липосомы в качестве средства доставки разных веществ в определенные органы и ткани.

2.2 Использование липосом как транспортных частиц

В последнее время липосомы находят все большее признание в мире как перспективные носители лекарственных веществ, поскольку многочисленные клинические испытания показали, что лекарства, вводимые в составе липосом, более эффективны и менее токсичны, чем вводимые в свободном виде.

Рис. 1

На рисунке 1. показаны различные по своей природе транспортные частицы для лекарств.

Достоинства липосом как носителей лекарств очевидны: полученные из природных фосфолипидов липосомы в отличие от полимерных систем доставки лекарств полностью биодеградируемы и биосовместимы, пригодны для включения в них многих фармакологических агентов, в том числе ферментов, гормонов, витаминов, антибиотиков, иммуномодуляторов, цитостатиков. Включенные в липосомы лекарственные вещества становятся более устойчивыми в организме, так как изолированы липидной мембраной от повреждающих воздействий внешних условий, в частности от разрушения в желудочно-кишечном тракте, и в свою очередь в меньшей степени оказывают общее токсическое действие на организм. Уникальной особенностью липосом является возможность доставки лекарственных препаратов внутрь клеток, с которыми они взаимодействуют путем слияния или эндоцитоза. Модифицируя мембрану липосом молекулами, обеспечивающими «узнавание» клетки или органа-мишени, можно осуществлять направленную транспортировку лекарств.

Рисунок 2. Схематичное изображение липосомы с лекарством

Особый интерес вызывает возможность орального применения липосомальных белковых препаратов, поскольку их инъекционные лекарственные формы быстро деградируют в желудке. Хотя механизм всасывания липосомальных препаратов в желудочно-кишечном тракте до конца не ясен, сообщений об их эффективности при пероральном приеме в литературе достаточно много. Так, например, несмотря на неоднозначные результаты по пероральному применению липосомального инсулина при лечении сахарного диабета, исследования в этом направлении продолжаются, а некоторые фирмы предполагают наладить промышленный выпуск этого препарата. Разработанный в дочернем государственном унитарном производственном предприятии (ДГУ ПП) «Вектор-Фарм» ГНЦ ВБ «Вектор» г. Новосибирска липосомальный генноинженерный альфа-2b интерферон (Липоферон) для энтерального применения (для приема внутрь) оказался эффективен при многих вирусных и ассоциированных с ними заболеваниях человека. В ряде клинических испытаний, проведенных в ведущих медицинских центрах страны, таких как ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ, НИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РФ, ГНЦ Институт иммунологии МЗ РФ, Институт гриппа, были получены положительные результаты у взрослых и детей при лечении острого и хронического гепатита В, как свободного, так и ассоциированного с гломерулонефритом, гриппа, ОРЗ, атопических заболеваний, таких как риноконъюнктивит и бронхиальная астма.

Спектр терапевтического применения Липоферона для перорального применения постоянно расширяется, так как продолжающиеся клинические испытания выявляют все новые нозологические формы заболеваний, при лечении которых он эффективен. Очень важно, что липосомальный интерферон в пероральной форме хорошо переносится больными. При его применении не обнаруживаются побочные эффекты, сопровождающие парентеральное применение интерферона, такие как повышение температуры, озноб, утомляемость, кожные высыпания, лейко- и тромбоцитопения. Естественный путь введения — «peros» — делает препарат незаменимым в педиатрической практике. Немаловажно и то, что при пероральном приеме липосомальных препаратов отсутствует риск передачи вирусов СПИДа и гепатита.

Использование липосом оптимально при необходимости направленной транспортировки лекарственного вещества к органам ретикулоэндотелиальной системы (селезенка, печень и т.д.). В настоящее время тщательно разработана система применения и лечения антибактериальными препаратами в липосомах так называемых «инфекций РЭС». Доказана эффективность подобных препаратов при многих заболеваниях (лейшманиоз, сальмонеллез, брюшной тиф, бруцеллез, малярия и др.), появились работы по использованию липосомальных противовирусных препаратов при герпесе, вирусном гепатите, лихорадке долины Рифт, ВИЧ-инфекции в эксперименте на животных. При парентеральном введении распределение липосом в организме зависит от состава липосомальной мембраны, их размера, заряда, других химических и физических параметров везикул и иммобилизованных в них веществ, а также от способа введения. Так, например, после подкожного введения основное количество липосом депонируется в месте введения и элиминируется оттуда преимущественно лимфогенным путем. Таким образом, местное введение липосомальных препаратов является оптимальным способом их доставки в регионарные лимфоузлы. При внутримышечном введении липосомы способны создавать депо препарата в месте введения, скорость элиминации из депо зависит от размера и свойств липосом и составляет от нескольких часов (если липосомы мелкие) до нескольких дней (если крупные). Мелкие бислойные липосомы в отличие от крупных при внутрибрюшинном или внутримышечном введении гораздо быстрее проникают в кровеносное русло, что указывает на ограниченную способность последних проходить через капилляры и мембраны сосудов. При внутривенном введении мелкие липосомы выводятся из кровотока медленнее, чем крупные.

Для повышения тропности (способность воздействовать на что-либо) липосом к определенным органам и тканям их изготавливают из фосфолипидов, изолированных из этих органов, или фиксируют на поверхности специфические антитела против соответствующих тканевых антигенов, или применяют так называемые молекулы-посредники, обладающие двумя типами сродства: с одной стороны — к клеткам макроорганизма, с другой — к липосоме. Как отмечают исследователи, липиды в определенной степени участвуют в «узнавании» клеток, поскольку каждому типу мембран соответствует определенное, характерное только для него соотношение полярных липидов. В процессе «узнавания» важную роль играют также гликолипиды (ганглиозиды), участвующие в межклеточных взаимодействиях и являющиеся специфическими рецепторами ряда биологически активных веществ. То есть механизм взаимодействия липосом с клетками определяют не только фосфолипиды, но и ганглиозиды, входящие в состав липосом. Изучение распределения липосом, содержащих фосфатидилхолин, холестерин и гликолипид, при внутривенном введении в организм показало, что наилучшим гликолипидом для липосом в отношении их переноса в ткани головного мозга и печени является сульфатид, в ткани селезенки — ганглиозиды, в ткани легких — сфингомиелин. Так, например, человеческий a-интерферон, иммобилизованный в липосомы, мембрана которых построена из фосфатидилхолина, холестерина и сульфатида, после внутрибрюшинного введения в большей степени обнаруживается в крови, печени, селезенке и опухолевой ткани мозга.

Если необходимо локальное воздействие на клинический процесс, то для исключения системного влияния на организм целесообразно местное применение лекарственных препаратов.

Липосомальные препараты по сравнению с традиционными лекарственными формами для наружного применения, такими как мази и гели, обладают большей способностью проникать в кожу и волосы, а потому они более доступны для живых клеток-мишеней. Установлено, что липосомы интенсифицируют процессы взаимодействия активных веществ с кожей при лечебной наружной терапии, что приводит к повышению терапевтической эффективности иммобилизованных в них лекарственных веществ. Вероятнее всего, такой эффект вызван слиянием липосом с липидными ламеллами, не доходя до базального слоя, и высвобождением их внутреннего содержимого. Подвижные липиды липосом встраиваются в липидные ламеллы, увеличивая таким образом «жидкостность» барьера, что улучшает проницаемость. Другим важным путем проникновения липосом и их содержимого вглубь кожи являются волосяные фолликулы. Эффективность трансдермального липосомального переноса лекарственных веществ можно усиливать, используя методы ионо- и фонофореза.

2.3 Применение липосом в лечении вирусных заболеваний

Многие исследователи считают, что применение липосом в вакцинации способно усилить действие вакцин и при этом позволит сэкономить значительные денежные средства.

По мнению Марка Дж. Остро, вице-президента «Liposome Company» (USA), занимающей в мире ведущее положение в развитии липосомной технологии, в ближайшее время найдут свое применение не менее 15 новых терапевтических средств, основанных на липосомной технологии. По оценке американских специалистов, в ближайшее время продажа липосом на мировом рынке составит 20–25 % средств доставки лекарственных препаратов. Ведущее положение в исследованиях и разработках липосомальных форм введения лекарственных средств занимают три американские компании — «The Liposome Company» (TLC), «Liposome Technology Inc.» (LTI), «Vestar». Благодаря их исследованиям на рынок уже введены липосомальный амфотерицин В (TLC) для лечения системных микозов, противоопухолевые липосомальные препараты — даунорубицин («Vestar»), доксорубицин (TLC — Dox 99), цисплатин (TLC). Многие препараты проходят завершающие стадии клинических испытаний — это и липосомальные вакцины против гриппа и меланомы, и противодиабетический комплекс инсулин-липосомы, и противовирусные нуклеозиды для лечения СПИДа, и серия липосомальных бронхорасширяющих препаратов и т.д.

Разумеется, создателям липосомальных препаратов предстоят дальнейшие исследования в данной области. Необходимо совершенствовать технологию производства липосомальных препаратов, добиваться большей стабильности готовых лекарственных форм, удешевлять производство. Однако опыт производства российского липосомального интерферона свидетельствует о возможности решения этих задач. По нашему мнению, на данном этапе развития науки о липосомах важно использовать в производстве липосомальных препаратов только природные материалы, поскольку введение липосом, приготовленных на основе природного лецитина (фосфолипид, в состав которого входит холин), не связано с риском развития токсичности, иммуногенности и возникновения аллергических реакций. Кроме того, на применение природного лецитина в производстве пищевых продуктов, косметических и лекарственных средств отсутствуют ограничения как в Европейском союзе, так и в инструкциях Управления по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США (FDA). Очень осторожно нужно подходить к применению у людей липосом, приготовленных из синтетических, полимеризованных липидов. Безусловно, полимерные липосомы, или липосомы второго поколения, значительно увеличат время циркуляции лекарств в кровотоке и, вероятно, за ними большое будущее, однако необходимо решить проблему токсичности и плохой биодеградации полимерных носителей

Липоферон – липосомированный препарат рекомбинантного α-2b интерферона – хорошо переносится больными и имеет высокую эффективность как в профилактике, так и лечении вирусных инфекций (грипп, ОРВИ, гепатиты В и С). Естественный путь введения (через рот) делает препарат незаменимым в педиатрической практике и при амбулаторном лечении.

Рекомбинантные α2-интерфероны (ИФН) обладают антивирусной, противоопухолевой и иммуномодулирующей активностью. Препараты ИФН широко применяются в комплексной терапии вирусных, бактериальных и онкологических заболеваний человека. Для достижения терапевтического эффекта необходимы ежедневные инъекции высоких доз препарата – от 1-2 до 50 млн МЕ, так как протеазы крови и других биологических жидкостей организма быстро разрушают ИФН. Парентеральное введение высоких доз ИФН часто сопровождается повышением температуры, ознобом, утомляемостью, кожными высыпаниями, лейко- и тромбоцитопенией и другими побочными эффектами. Так, при лечении хронического гепатита С побочные эффекты наблюдаются у 72% больных.

Создание препаратов рекомбинантного ИФН, не вызывающих побочных эффектов, – крайне актуальная проблема. Одним из подходов к решению этой сложной задачи является липосомирование, т. е. заключение ИФН в липосому. На международном фармрынке уже представлен липосомальный амфотерицин В для лечения системных микозов, противоопухолевые липосомальные препараты – даунорубицин, доксорубицин, цисплатин. Целый ряд препаратов находится на завершающих фазах клинических испытаний: липосомальные вакцины против гриппа и меланомы, противодиабетический комплекс инсулин-липосомы, противовирусные нуклеозиды для лечения СПИДа, серия липосомальных бронхорасширяющих препаратов и др. Эти препараты значительно менее токсичны, чем нелипосомированные.

Достоинства липосом как носителей лекарств состоят в том, что, полученные из природных фосфолипидов, они в отличие от полимерных систем доставки лекарств полностью биодеградируемы и биосовместимы. Включенные в липосомы лекарственные вещества оказываются более устойчивыми в организме, так как изолированы липидной мембраной от повреждающих воздействий, в частности от разрушения в желудочно-кишечном тракте, поэтому в меньшей степени оказывают общетоксическое действие на организм. Уникальной особенностью липосом является возможность доставки лекарственных препаратов внутрь клеток, с которыми они взаимодействуют, путем слияния или эндоцитоза. Особый интерес вызывает возможность орального применения липосомальных белковых препаратов.

Специалисты ДГУ «Вектор-Фарм» ГНЦ ВБ «Вектор» в течение 10 лет разрабатывали и внедряли в медицинскую практику липосомальный генно-инженерный α-2b ИФН (торговое название в Украине – Липоферон) для перорального применения. В состав препарата Липоферон входят только фармацевтически приемлемые компоненты. Препарат выгодно отличается отсутствием в составе альбумина, способного вызывать аллергические реакции. Пероральное применение Липоферона надежно защищает организм больного от риска передачи инфекций (ВИЧ, вирусы гепатитов В, С (ВГВ, ВГС)) при инъекциях. Также отсутствует психоэмоциональный фактор, характерный для инъекций, особенно у детей. Готовая форма препарата представляет собой лиофильно высушенный продукт, восстанавливающий липосомальную структуру при добавлении воды.

В результате доклинического исследования было установлено, что ИФН, заключенный в липосомы, сохраняет биологическую активность в желудочно-кишечном тракте и всасывается в кровь. По скорости всасывания ИФН, заключенный в липосомы и применяемый перорально, оказался близок к свободному ИФН, вводимому внутримышечно, но в остальном фармакокинетика препаратов заметно отличалась. Так, например, высокий уровень накопления ИФН в сыворотке крови мышей регистрировался через 1 ч независимо от применяемой лекарственной формы препарата. Липосомальный ИФН отличался более длительным периодом циркуляции в крови лабораторных животных, его период полувыведения составлял 6 ч, в то время как у Реаферона-ЕС – 3 ч. К 6 ч уровень ИФН в сыворотке крови после введения Реаферона падал до фоновых значений, после введения Липоферона это происходило к 9 ч, с последующим новым подъемом к 15 ч.

2.4 Липосомы и противотуберкулезная терапия

Гидразид никотиновой кислоты — основной противотуберкулёзный препарат. Если упаковать его в липосомы, это позволит адресно доставлять лекарство к микобактериям туберкулёза. Исследованиями в этой области занимаются специалисты Научного центра клинической и экспериментальной медицины СО РАМН при поддержке федеральной целевой программы Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007—2012 годы.

При туберкулёзном воспалении образуются гранулемы, которые состоят из клеток иммунной системы макрофагов, набитых микобактериями туберкулёза. Поэтому в макрофаги необходимо доставить лекарство. Адресная доставка позволит снизить токсическую нагрузку на печень. Макрофаги обладают способностью заглатывать мелкие частицы, поэтому предлагаемое лекарство, гидразид никотиновой кислоты, упаковывают в липосомы. Новосибирские учёные создали молекулярно-липосомальные гибридные композиции (МЛГК) размером от 200 до 450 нм, которые содержат окисленные декстраны, связанные с лекарством. Теперь исследователи проверяют, какие факторы могут повлиять на эффективность заглатывания МЛГК фагоцитами.

Учёные провели эксперименты на мышиных макрофагах. Клетки обработали ферментами и соединениями, которые теоретически могли бы помешать макрофагам поглощать липосомы. Процесс поглощения можно условно разделить на две стадии: сначала МЛГК налипают на клетки, а потом попадают внутрь. Оказалось, что слущивание с поверхности фагоцитов белковых молекул, способных выполнять функции рецепторов, не играет роли в прилипании МЛГК к мембранам клеток. Несколько ослабить этот процесс может пониженный метаболизм в клеточных мембранах.

Собственно фагоцитоз, то есть доля клеток, поглощающих липосомы, и количество липосом, которые заглатывает одна клетка, зависит от подвижности цитоскелета клетки, то есть возможности мембраны втягиваться и выпячиваться, и от уровня метаболизма на клеточных мембранах. Нарушения этих процессов снижают активность фагоцитоза вдвое, но, тем не менее, поглощение МЛГК всё равно происходит. Исследователи пришли к выводу, что макрофаги активно захватывают лекарство, заключённое в липосомах, поэтому МЛГК в состоянии обеспечить его адресную доставку к микобактериям туберкулёза.

2.5 Использование липосом в химиотерапии при онкозаболеваниях

Стандартной экструзией через калиброванные ядерные мембраны получены стабильные липосомы среднего диаметра 100 нм на основе природных фосфолипидов и липофильных пролекарств широко применяемых химиотерапевтических средств – метотрексата и мелфалана. Липосомы показали эффективность при системном введении мышам с экспериментальными опухолями. Фармакокинетика метотрексата в плазме крови мышей свидетельствует о преимуществах его применения в виде липофильного пролекарства в липосомах.

Открытие явления пассивного транспорта частиц примерно 100-нм размеров в опухоли и очаги воспаления [1] послужило импульсом для бурного развития исследований в области разработки систем доставки лекарств. Применение нанотехнологий уже является общепризнанной в мире стратегией развития фармацевтического производства на ближайшие десятилетия. Включение лекарств в биосовместимые полимерные или супрамолекулярные носители уменьшает концентрацию свободных препаратов в кровотоке и препятствует их быстрому выведению почечной системой, что позволяет уменьшить общую токсичность и увеличить терапевтический индекс за счет улучшения фармакокинетики и биораспределения. Накопление наноразмерных носителей в опухолях и очагах воспаления осуществляется благодаря дефектной архитектуре формирующейся de novo сосудистой системы и повышенной проницаемости ее эндотелия. В то же время, высокое интерстициальное давление в солидных (твердых) опухолях не позволяет удерживаться в них частицам с размерами менее 30–40 нм (эффект enhanced permeability and retention). Оптимальный размер носителей, обеспечивающий пассивный транспорт лекарств, попадает в интервал 50–150 нм. Липосомы, наряду с липидными наносферами, относятся к наиболее био- и гемосовместимым носителям и пригодны для системного введения в организм. Липосомы более 30 лет назад привлекли внимание в качестве систем доставки лекарств. Исследования получили новый импульс после разработки технологии получения липосом Stealth® [2]. Поверхность таких липосом защищена от опсонизации (адсорбции белков плазмы) и преждевременного вывода из кровотока клетками иммунной системы благодаря экранированию привитыми высокогидратированными остатками полиэтиленгликоля. Препараты на основе Stealth-липосом применяются в клинике уже более 10 лет: например, липосомы с доксорубицином (Doxil, Caelix и др. производства США, стран ЕС, Украины) – для лечения саркомы Капоши и рака яичников [3]. Однако создание подобных конструкций для широкого спектра водорастворимых средств оказалось невозможным, поскольку метод активной загрузки, применяемый при их производстве, пригоден лишь для ограниченного числа лекарств, имеющих природу слабых амфифильных кислот или оснований (например, антибиотики антрациклинового ряда типа доксорубицина). Альтернативный лабораторный способ – формирование липосом в водно-солевом растворе лекарства с последующим отделением от невключившегося агента – нетехнологичен.

Мы предлагаем включать лекарства в липидный бислой липосом в виде липидных производных – липофильных пролекарств, которые расщепляются внутриклеточными ферментами с высвобождением исходного препарата. Такой подход упрощает технологию получения лекарственных липосом и делает ее универсальной. Более того, по сравнению с инкапсулированием в водный объем липосом, включение в бислой позволяет улучшить фармакологические свойства системы доставки в целом, благодаря уменьшению потерь лекарства как в кровотоке, так и при взаимодействии липосомы с клеткой. Очевидно также, что липидные производные способны к прямому трансмембранному переносу, что кардинально меняет механизм эндоцитоза и внутриклеточного трафика препарата и облегчает разгрузку липосом. Для сравнения, чтобы обеспечить выход лекарства из водного объема Stealth-липосом после их попадания в эндосомы клетки-мишени, предлагается использовать рН-чувствительные молекулярные триггеры, в том числе пептидные, фосфолипидные и др. Низкая эффективность внутриклеточной разгрузки, обусловленная жесткостью липидного бислоя (температура его фазового перехода превышает 60С) и затрудненным слиянием с клеточными мембранами – один из существенных недостатков Stealth-липосом.

Нами разработаны синтезы липидных производных широко применяемых в клинике химиотерапевтических средств: мелфалана (и его рацемата сарколизина) и метотрексата [4, 5]. Цитотоксик мелфалан – алкилирующий агент, действующий независимо от стадии клеточного цикла, – применяется в химиотерапии почти 50 лет. Цитостатик метотрексат, антиметаболит фолиевой кислоты, также давно используется для лечения онкологических и аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, где он по-прежнему остается «лекарством номер один». Связь между лекарством и остальной частью молекулы пролекарства должна легко гидролизоваться внутри клетки. Поскольку эстеразы обладают меньшей специфичностью, чем амидазы, и широко представлены во всех органах и тканях, предпочтительна сложноэфирная связь, а не амидная. Кроме того, при разработке молекулярных структур липидных конъюгатов учитывалось их наилучшее соответствие упаковке липидного бислоя липосом (рис. 1).

Рис. 3. Молекулярные структуры липидных конъюгатов лекарств и схематическое изображение лекарственной липосомы

Липосомы с пролекарствами формируются стандартным методом экструзии: липидные пленки, полученные из смеси всех амфифильных компонентов (яичный фосфатидилхолин, фосфатидилинозит из пекарских дрожжей и пролекарства), подвергаются гидратации буферным физраствором, затем 5-6 циклам замораживания (жидкий азот) – оттаивания и наконец, 10-20-кратной экструзии при температуре не выше +40С через поликарбонатные мембранные фильтры с размерами пор 100 нм. Для экструзии мы используем установку фирмы Lipex (Канада) при давлении азота до 50 ат или ручной экструдер Avanti (США), в зависимости от количества требуемых препаратов. На рис. 2 приведены электронные микрофотографии дисперсий липосом, полученные методом замораживания-скалывания, который наиболее адекватно отражает размеры и структуру исходных липосом в водной фазе [6].

Рис. 4. Электронные микрофотографии реплик с поверхностей скола замороженных дисперсий липосом, нагруженных: А, а – липидным конъюгатом метотрексата; Б, б – липидным конъюгатом мелфалана

Очевидно, что липосомы, содержащие до 10 мол. % липофильных пролекарств, действительно представляют собой моноламеллярные везикулы диаметром до 100 нм. Известно, что фосфатидилинозит стабилизирует мембрану липосом, подобно остаткам полимера в Stealth-липосомах. Мы полагаем, что этот природный фосфолипид не должен вызывать нежелательные побочные эффекты, которые сопутствуют повторному применению липосом с полиэтиленгликолем [7].

Физико-химическая стабильность липосом исследована нами с помощью динамического лазерного светорассеяния, электронной микроскопии и гель-хроматографии в сочетании со спектрофотометрическим анализом на хромофоры лекарств и липидный фосфор. Показано, что пролекарства полностью (нагрузка липидного бислоя до 10 мол. %) встраиваются в мембрану липосом и образуют стабильные дисперсии, содержащие лекарственное начало в концентрациях, пригодных для системного введения животным. Такие дисперсии можно хранить несколько дней при +4 С. Однако сами лекарства, в особенности остаток мелфалана, в водной среде подвергаются постепенной деградации. Для длительного хранения дисперсии можно замораживать при –196 С и хранить при температурах ниже –20 C; перед применением их необходимо разморозить и кратковременно обработать на ультразвуковой бане. Действительно, агрегаты липосом, образовавшиеся после размораживания дисперсий (рис. 3,б), диспергируются с восстановлением исходных наноразмерных липосом (рис. 3,в).

Рис. 5. Электронные микрофотографии липосом с липофильным пролекарством мелфалана (метод негативного контрастирования):

а – через 20 ч после получения; б – после размораживания замороженных в жидком азоте дисперсий; в – после обработки размороженных дисперсий на ультразвуковой бане

Состав липосом при этом также сохраняется: липофильнеые пролекарства не выделяются из липидного бислоя липосом в отдельные агрегаты [6]. Таким образом, глубокое замораживание без криопротекторов может быть одним из способов длительного хранения липосомальных препаратов с липидными конъюгатами мелфалана и метотрексата.

Другой вопрос: какова стабильность сложноэфирных связей липофильных пролекарств после внутривенного введения липосомальных дисперсий? На примере конъюгата метотрексата нами показано, что пролекарства в составе липосом устойчивы к преждевременному гидролизу эстеразами плазмы крови человека [8]. Действительно, высокоэффективная жидкостная хроматография со спектрофотометрическим детектированием продемонстрировала стабильность пролекарства метотрексата при инкубации in vitro в плазме крови вплоть до 24 ч. Очевидно, липосомы защищают сложноэфирные конъюгаты от действия внеклеточных эстераз.

Проведена первая серия экспериментов по изучению фармакокинетики липосомального конъюгата метотрексата. В РОНЦ РАМН разработан и широко применяется в клинике метод анализа фармакокинетики метотрексата и продукта его метаболизма 7-гидроксиметотрексата с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Исследования, проведенные нами на контрольной группе мышей СВАхC57Bl/6(F1), показали, что фармакокинетика метотрексата при его внутривенном введении в эквивалентной дозе (10 мг/кг) значительно отличается от таковой для конъюгата метотрексата в липосомах. Отметим, что методика проведения хроматографического анализа конъюгата метотрексата до конца не разработана и должна быть оптимизирована. Тем не менее уже первые результаты показывают перспективность липосомального препарата. Приведем некоторые данные. Период полувыведения конъюгата метотрексата, соответствующий быстрой фазе распределения по органам и тканям, в девять раз выше, чем интактного метотрексата (3,6 против 0,4 мин). Период полувыведения из плазмы конъюгата превышает почти в 3,5 раза показатель для исходного лекарства (40 мин против 12). Последующее образование собственно метотрексата из пролекарства происходит гораздо более замедленно, в результате период его полувыведения значительно увеличивается и составляет 196 мин по сравнению с 12 мин при введении интактного лекарства. Таким образом, липосомальный препарат является пролонгированной формой метотрексата. Приведенные результаты могут свидетельствовать о более высоком терапевтическом потенциале новой лекарственной формы метотрексата в виде диглицеридного конъюгата, заключенного в липосомы, при таких системных гематологических заболеваниях, как злокачественные лейкозы и лимфомы. Доказательством этому предположению служит тот факт, что при введении липосомального препарата величина экспозиционной дозы в сыворотке крови по метотрексату превышала более чем в два раза таковую после введения самого лекарства в эквивалентной дозе.

Терапевтическая эффективность липосом с липофильными пролекарствами показана нами in vivo на моделях рака молочных желез и лимфолейкозов. Увеличение продолжительности жизни мышей c перевитым лейкозом Р-388 при лечении липосомальным препаратом диглицеридного конъюгата сарколизина возросло в 1,5 раза, по сравнению с лечением интактным лекарством [9], а при лечении мышей BLRB c перевитым раком молочных желез этот показатель увеличился в два раза [10]. Недавно нами проведено кратковременное лечение острого Т-лимфолейкоза мышей метотрексатом и липосомальными препаратами конъюгата метотрексата. Эта модель лимфолейкоза проявляет сходство с Т-клеточными лимфомами человека, которые очень агрессивны и трудно поддаются химиотерапевтическому лечению. Тем не менее даже в режиме умеренной терапии липосомы с конъюгатом метотрексата показали улучшение выживания по сравнению с исходным лекарством почти на 10 %. Необходимы дальнейшие исследования для оптимизации режимов лечения (дозы, число инъекций и т.д.) и исследования фармакокинетики и биораспределения лекарственных липосом, которые уже зарекомендовали себя как перспективную систему доставки для наномедицины.

2.6 Иммуносомы-разновидность липосом

Оригинальным направлением в липосомологии явилась разработка нового поколения лекарственных препаратов – иммунолипосом. Иммунолипосомы представляют собой липосомы, к которым прикреплены моноклональные антитела (МКА). МКА обеспечивают специфическое связывание липосом с антигенпозитивными клетками, а липосомы несут соответствующий гидрофобный или гидрофильный химиотерапевтический препарат.

В настоящее время различают три типа иммунолипосом: А, В и C [3]. В иммунолипосомах типа А МКА ковалентно связаны с обычными липосомами посредством короткого якоря. Тип B – это уже пегилированные липосомы, в которых МКА также ковалентно связаны с ними посредством короткого якоря. Тип С (Pendant-type PEG-immunoliposomes) – это стерически стабилизированные ПЭГ липосомы, в которых МКА прикреплены к дистальному терминальному концу ПЭГ.

С помощью липосом типа А было убедительно продемонстрировано, что иммунолипосомы более эффективно доставляют лекарства в клетки-мишени по сравнению с обычными липосомами в тестах как in vitro, так и in vivo [4]. Однако связывание иммунолипосом с клетками-мишенями in vivo было более сложным. Изучение иммунолипосом in vivo показало, что прикрепление к липосомам антител усиливало их захват мононуклеарами РЭС. Эффективность связывания иммунолипосом с клетками-мишенями зависела от плотности антител на поверхности липосом. Захват иммунолипосом клетками РЭС и эндотелиальный барьер, разделяющий сосудистое русло от опухолевой ткани, побудили исследователей к созданию нового типа липосом. Это привело к конструированию стерически стабилизированных иммунолипосом, с удлиненным периодом циркуляции в крови.

В первых работах по созданию долгоциркулируюших иммунолипосом к стерически стабилизированным липосомам, содержащим фосфолипиды с модифицированными ПЭГ головными группами, антитела были прикреплены через короткий гидрофильный якорь близко к поверхности липосом (липосомы типа B) [5]. Эти липосомы сохраняли свойство долговременной циркуляции, но взаимодействие с клетками-мишенями было угнетено по тому же механизму, как и угнетение захвата мононуклеарами РЭС, т.е. из-за блокады ПЭГ [6].

Позже МКА были прикреплены к дистальным концам цепей ПЭГ, связанным с липосомами (липосомы типа С). Это привело к сохранению способности стерически стабилизированных липосом специфически связываться с клеточной поверхностью клеток-мишеней и быть защищенными от захвата мононуклеарами РЭС [7].

липосома транспортный частица лечение терапия

Сравнение эффективности специфического связывания и захвата мононуклеарами РЭС этих трех типов иммунолипосом, проведенное K. Maruyama [3] на модели МКА 34А против поверхностного эпителия легких, показало, что 42,5% липосом типа А накапливаются в легких, а в крови и печени выявляется небольшое количество. При введении липосом типа С специфически связываются 56,6% от введенной дозы липосом. В крови и печени накапливалось меньше препарата (7%), чем при инъекции липосом типа А. Липосомы типа B показали низкий уровень специфического связывания и около 60% препарата от введенной дозы долго циркулировало в крови. Таким образом, наиболее перспективными являются липосомы типа С.

В настоящее время для ковалентного прикрепления МКА к терминальным концам ПЭГ, с целью получения стабильной связи антител с ПЭГ, используют три метода, т.е. связывание через серу (thiother) [7], амидные группировки (amide) [3] и гидразоны (hidrazone) [8].

К антителам, используемым в конструировании иммунолипосом, предъявляют определенные требования. МКА должны сохранить свою специфичность при конъюгации с липосомами, иметь афинность, достаточную для связывания низкой концентрации иммунолипосом, обладать низкой иммуногенностью. С этой целью используют гуманизированные МКА, для удаления мышиного белка, а также Fab' фрагменты антител для удаления фрагментов Fc. Антитела должны эффективно интернализовываться клетками-мишенями путем эндоцитоза, обладать биологической активностью и усиливать противоопухолевый ответ. МКА должны быть технологичны в производстве и иметь достаточный срок хранения [9].

К антигену, являющемуся мишенью для иммунолипосом, также имеются определенные требования. Он должен сильно и гомогенно экспрессироваться в опухолевой ткани, быть жизненно важным для опухолевой клетки и не исчезать с клеточной поверхности. Антиген должен минимально слущиваться с поверхности опухолевой клетки для избежания связывания иммунолипосом с растворимым антигеном или усиления клиренса. Комплекс антиген–иммунолипосома должен пиницитироваться в опухолевую клетку.

Связь антител с липосомами должна быть стабильной в крови. Якорь не должен связываться с распознающим местом на молекуле антител и быть иммуногенен, должен быть нетоксичен и избегать опсонизации, не должен влиять на препарат в липосоме, стабильность липосомной мембраны и оказывать стерическое препятствие.

Эффективное связывание иммунолипосом с клетками-мишенями происходит лишь тогда, когда мишени находятся в сосудистом пространстве или когда иммунолипосомы проходят сквозь слабую сосудистую стенку. В литературе рассматриваются два анатомических подхода. Первый – это уже существующие внутрисосудистые места, такие как поверхностный эндотелий сосудов, клетки крови или тромбы. Второй – менее доступные места, такие как солидные опухоли, места инфекции или воспаления, в которых сосудистые структуры слабы [3]. Доказано, что капиллярная проницаемость эндотелиального барьера во вновь васкулиризируемых опухолях значительно выше, чем в нормальных тканях. Нормальные ткани выстланы нефенестрированным сосудистым эндотелием, и прохождение макромолекул или липосом в ткань затруднено. Кроме того, в опухолевой ткани практически отсутствует дренирование лимфатической системой, поэтому макромолекулы и липосомы накапливаются в опухолевой ткани и остаются там длительное время. Несколькими методами в различных опухолевых моделях на мышах было убедительно доказано, что липосомы диаметром 100–200 нм проходят через сосудистую стенку и накапливаются в опухолевой ткани.

Большое значение имеет соотношение антител к липидам в иммунолипосоме. Так, при весовом соотношении 1:50 к одной липосоме присоединялось 24 молекулы моноклональных антител, а при соотношении 1:1 – 935 молекул антител. Специфическое накопление иммунолипосом, конструированных при соотношении 1:50, было 3% от введенной дозы, а созданных при соотношении компонентов 1:1 – 60% от введенной дозы иммунолипосом. Захват иммунолипосом клетками печени снижался с 50% от введенной дозы для липосом с низким содержанием антител до 12% для липосом с высоким содержанием антител. При этом захват иммунолипосом, содержащих низкое количество антител, не отличался от захвата обычных липосом. Иммунолипосомы, которые не связались с клетками-мишенями при первых нескольких пассажах через опухолевые капилляры, накапливались в печени и селезенке [3].

Специфическая доставка противоопухолевых препаратов с помощью иммунолипосом способствовала лучшей терапевтической эффективности и снижению токсичности по сравнению с обычными липосомами [1]. Это было убедительно продемонстрировано на моделях солидных опухолей у мышей [10] на ксенотрансплантатах человеческой B-клеточной лимфомы у голых мышей [8].

К настоящему времени описано несколько препаратов иммунолипосом, потенциально перспективных для применения в онкологической практике. Они направлены против клеток, экспрессирующих антигены CD71 (рецептор трансферрина), Her2/neu (рецептор эпидермального фактора роста) [11], HLA-DR (антигены гистосовместимости II класса) [12, 13], CD19 (обще-В-клеточный маркер) [8], LL2 (антиген В-клеточной лимфомы) [14] и др.

Глава 3. Технология получения липосом

3.1 Структура липосомы

Мембрану липосом обычно формируют из тех же фосфолипидов, которые входят в состав биологических мембран: фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина. Это позволяет достичь полной биосовместимости липосом. Липосомы готовят различными способами, например, подвергая смесь фосфолипидов и воды воздействию ультразвуком, замораживанию и оттаиванию, экструзии через фильтры с наноразмерными порами. В последнее время для получения липосом используют технологию суперкритических растворов. С помощью этих методов можно получить многослойные липосомы, а также крупные и мелкие однослойные липосомы. Размеры липосом, в зависимости от метода их изготовления, могут быть от нескольких микрон до десятков нанометров (наносомы). Если при изготовлении липосом используется водный раствор лекарственного вещества, то часть этого раствора оказывается замкнутой внутри липосомального контейнера и в виде такой лекарственной формы вводится в организм человека. Это важно в тех случаях, когда вводится токсическое соединение, например, противораковый агент, или если лекарственное вещество необходимо защитить от разрушения до момента его доставки к цели. Неполярные органические лекарственные соединения встраиваются в мембрану липосомы и также могут доставляться к цели. Для направленной доставки содержимого липосом к их поверхности ковалентно пришивают адресные моле кулы, например, антитела к поверхностным белкам клеток-мишеней, витамины. Пришивка молекул полиэтиленгликоля защищает сами липосомы от захвата клетками иммунной системы и, таким образом, увеличивает время нахождения липосом в кровотоке. Липосомы доставляют лекарственное вещество в клетки либо путем слияния с их мембраной, либо за счет эндоцитоза. Липосомы как наноконтейнеры для лекарственных веществ применяются в медицине при лечения рака, а также в составе косметических кремов.

Липосомы, или липидные пузырьки, известны давно, да и знакомы, наверно, каждому: очень похожи на них те капельки жира, которые попадают в воду, но это, разумеется, сходство чисто внешнее. Конечно, те, о которых пойдет речь, очень малы – много меньше клетки, и жир в них не пищевой, а клеточный – липиды, входящие в состав всех клеток организма. Липосомы представляют собой замкнутые пузырьки воды, окруженные одним или несколькими слоями липидов.

3.2 Механизм действия липосом

Рис. 6 Липосома в процессе слияния с клеточной мембраной (компьютерная модель)

Как носители лекарств липосомы наиболее широкое применение получили в экспериментальной онкологии. Суть в том, что существует ряд препаратов, весьма эффективно разрушающих злокачественные клетки или тормозящих их рост. Однако применить их в терапевтических целях не всегда возможно из-за их большой токсичности или плохой растворимости в воде. С помощью липосом эти трудности можно преодолеть. Так, в одной лаборатории с помощью липосом вводили мышам, больным лейкемией, нерастворяющиеся препараты и наблюдали замедление роста числа злокачественных клеток. Другие исследователи нагружали липосомы антрациклинами: эти вещества активны против широкого круга злокачественных опухолей, но весьма ядовиты для остальных тканей, особенно для сердечной мышцы, – и вредное воздействие этих соединений значительно снижалось, что, как следствие, позволяло существенно увеличивать их дозы.

Липосомы можно использовать и для борьбы с инфекционными заболеваниями. Весьма показательными в этом плане могут служить экспериментальные данные по лечению лейшманиоза – заболевания, широко распространенного в южных странах, где различными его формами страдает около 100 миллионов человек. Болезнь поражает печень, селезенку, костный мозг.

Рис 7. Способы проникновения содержимого липосом в клетку

3.3 Технологии получения липосом

Для получения липосом известны различные способы. Так, например, они могут быть получены способом дегидратации/регидратации, в соответствии с которым липид растворяют в органическом растворителе, таком как хлороформ, дихлорметан или спирт, такой как метанол или этанол. Затем раствор высушивают с использованием, например, роторного испарителя, после чего на стенке испарительной колбы образуется пленка липида. Добавление к сухой пленке воды или водного раствора, такого как буфер, приводит к образованию многослойных липосом. Образованием именно этого продукта завершается первая стадия образования везикул с использованием различных методик. Последующая обработка может приводить к дегидратации/регидратации везикул, или ДРВ (DRV) (Kirby and Gregoriadis, Biotechnology (1984) 2, 979-984). Альтернативно, при последующей обработке ультразвуком липидной суспензии получают однослойные липосомы (A.D.Bangham et al., J. Mol. Biol. 13, 238 (1965)).

Другие известные в технике способы включают детергентную обработку (Y. Kagawa et al. , J. Biol. Chem. (1971) 246, 5477), выпаривание с обращением фаз (F. Szoka and D.Рараhadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sci, USA (1978) 75, 4194) и введение эфира (D.Deamer et al., Biochim. Biophys. Acta, (1976) 433, 629), а также лиофилизацию (см., например, работу Ohsawa et al., Chem. Pharm. Bull, (1984) 32, 2442-5 and Kirby and Gregoriadis (1984) supra.) и методы замораживания - оттаивания (D.D.Lasic "Liposomes: From Physics to Application, Elsevier, 1993, p. 98).

В зависимости от применяемого для образования липосом способа получают липосомы разного размера и с различающимися характеристиками. Липосомы могут использоваться для инкапсулирования материалов, таких как биологически активные продукты, в частности фармацевтические средства, включая вакцины, а также нефармацевтические средства, такие как продукты, воздействующие на кожу, в частности препараты для искусственного загара и другие средства макияжа. Методики инкапсулирования варьируют в зависимости от природы инкапсулируемого реагента и размера и свойств образованных липосом.

Размер липосом важен с точки зрения их применения. В некоторых случаях нужны крупные липосомы, в тех случаях, например, когда инкапсулируются частицы, включающие микроорганизмы, такие как бактерии, для получения, например, вакцин, как описано в документе WO 95/09619.

Однако во многих случаях предпочтительны мелкие липосомы. Это связано с тем, что мелкие липосомы не так быстро удаляются ретикуло-эндотелильной системой (РЭС), и в меньшей степени, чем крупные липосомы (с размерами свыше 200 нм). Захват везикул в РЭС возрастает с увеличением их размера. Кроме того, крупные липосомы при их внутримышечной инъекции не способны эффективно достичь регионарных лимфатических узлов и доставить в них вакцины и другие средства (Gregoriadis G. , Liposomes as Drug Carriers: Recent Trends and Progress, Wiley Chichester, 1988).

Липосомные препараты, содержащие различные лекарственные средства, могут быть оптимизированы с точки зрения содержания лекарственного ингредиента, стабильности, картины биологического распределения и уровня поступления в клетку путем изменения физико-химических параметров липосом, таких как температура фазового перехода, размер липосом, характер распределения препарата по размеру, величина поверхностного заряда, гидратация поверхности соединениями, несущими гидрофильные группы, и характер распределения по размеру частиц.

Размер липосом представляет собой параметр, который определяет фракцию, захватываемую РЭС (Senior et al., Biochem., Biophys., Acta (1985) 839. 1-8: Nagayasu et al. , Biol. Pharm. Bull. (1995) 18 (7), 1020-1023). Мелкие липосомы могут быть получены при использовании гомогенизаторов под высоким давлением (Talsma et al., Drug Development and Industrial Pharmacy (1989) 15 (2) 197-207, Vemuri S. et al., Drug Development and Industrial Pharmacy (1990) 16 (15), 2243-2256), но при этом используют большие количества липидов, для того чтобы добиться приемлемой величины коэффициента отношения включенного лекарственного средства к липидной массе. При использовании другого подхода (Gresoriadis et al. , Int. J. Pharm. 65 (1990) 235-242) в псевдоожиженном слое многослойных дегидратированных-регидратированных везикул (ДРВ) в присутствии неинкапсулированного лекарственного средства получают везикулы с размером менее 200 нм, сохраняющие количество первоначально включенных растворенных веществ.

Показан стабилизирующий эффект на везикулы, возникающий при добавлении сахара после получения липосом (Crowe L.M. et al., Arch. Biochem. Biophys. 242 (1985) 240-247, Hauser et al., Biochem. Biophys. Acta (1987) 897, 331-334), в том случае, например, когда липосомы, содержащие лекарственное средство, лиофильно высушивают для хранения и затем подвергают повторной гидратации.

Предлагается способ получения липосомного препарата, содержащего реагент, который включает следующие стадии:

(1) образование пустых липосом;

(2) смешивание липосом, полученных на стадии (1), с раствором сахара и указанного реагента и

(3) высушивание смеси, полученной на стадии (2).

При повторной гидратации высушенного материала, полученного на стадии (3), образуются липосомы, содержащие включенный в них реагент. При получении таким способом липосом увеличение их размера относительно липосом, образуемых на стадии (1), происходит в значительно меньшей степени, чем в случае липосомных препаратов, которые не содержат сахара. И в этом случае указанные выше процессы экструзии, обработки в псевдоожиженном слое или гомогенизации могут быть исключены.

Установлено, что в ходе сушки с использованием соответствующих концентраций сахаров, до определенной степени снижается уровень слияния и агрегации липосом при образовании аморфной стеклоподобной массы (Crowe et al., Arch. Biochem. Biophys. , 242 (1985) 240-247), а также взаимодействие сахаров с основной группой фосфолипидов (Crowe et al., Cryobiology, 31 (1994) 355-366). В ранних исследованиях дегидратированные/регидратированные везикулы (ДРВ) получали без использования cахаров в качестве стабилизаторов, при этом процедура основывалась на индукции слияния/агрегации образующихся мелких однослойных везикул при контролируемой регидратации (Kirby, Gregoriadis, 1984). В этой связи, можно было предположить, что общая стабилизация мелких однослойных везикул за счет добавления соответствующих количеств cахаров будет сопровождаться при восстановлении исходных MOB (SUV) очень низкой величиной включения.

Однако оказалось, что это не так. Хотя, как и в случае всех липосом, степень включения реагента зависит в некоторой мере от характеризующего систему коэффициента отношения липид:реагент, тем не менее ожидается, что уровень инкапсулирования реагента в липосомы, достигаемый при использовании способа по настоящему изобретению, будет вполне приемлемым.

Кроме того, применение липосом в качестве системы доставки лекарств налагает определенные требования к их физической и химической стабильности. Липосомы в виде водной дисперсии подвергаются гидролизу и физическим изменениям в процессе хранения, включая подтекание инкапсулированных лекарственных средств, а также изменение размеров в результате агрегации или слияния. Однако ожидается, что физическая и химическая стабильность липосом, получаемых по способу настоящего изобретения, будет хорошей.

Таким образом, настоящий способ дает возможность получать мелкие липосомы с высокой загрузкой, которые, как отмечалось выше, будут особенно полезны при создании фармацевтических композиций. Кроме того, заявленный способ может использоваться для приготовления инкапсулированных материалов разных типов.

Однако способ согласно настоящему изобретению будет особенно полезен при изготовлении липосом для применения в фармацевтической области. В этом случае используемые в рамках данного способа реагенты будут включать биологически активный материал, такой как фармацевтический ингредиент или лекарственное средство. Для этой цели получаемые на стадии (i) липосомы должны представлять собой мелкие однослойные везикулы со средним размером, например, в диапазоне от 25 нм до 90 нм, предпочтительно в диапазоне от 50 нм до 90 нм и наиболее предпочтительно от 70 нм до 90 нм. В конечном итоге, получаемые в рамках этого способа липосомы будут иметь все еще небольшой размер, в среднем менее 500 нм и обычно от 100 до 200 нм.

Имеющиеся на стадии (1) липосомы представляют собой пустые липосомы, получаемые посредством любого традиционного способа, например с помощью описанного выше классического способа. При этом любые образованные липосомы, в случае если их средний размер слишком велик для целевого использования, могут быть уменьшены с помощью известных в технике способов, например ультразвука, гомогенизации, экструзии или техники псевдоожиженного слоя.

Для получения липосом используют известные в технике липиды. Они включают, например, лецитины, такие как, например, фосфатидилхолин (ФХ), дипальмитоилфосфатидилхолин (ДПФХ), дистеароилфосфатидилхолин (ДСФХ), или заряженные липиды, в частности анионные липиды, такие как фосфатидиновая кислота, или катионные липиды, такие как стеариламин, необязательно в присутствии холестерина. Предпочтительным липидом является ДСФХ. Выбор липида зависит, в определенной мере, от природы активного средства и от цели использования липосом.

Приемлемые для использования на стадии (2) растворы сахаров включают водные растворы моносахаридов, таких как глюкоза и фруктоза, дисахаридов, таких как лактоза или сахароза, а также полисахаридов. Особенно предпочтительным для использования в способе настоящего изобретения сахаром является дисахарид, такой как сахароза или лактоза, или моносахарид, такой как глюкоза. В особенности, в качестве сахара предпочтительна сахароза.

В предпочтительном варианте на стадии (2) используют такое количество сахара, чтобы отношение массы сахара к массе липида составляло от 1:1 до 6:1 (вес/вес) и более предпочтительно - в диапазоне от 1:1 до 5:1 (вес/вес). Было обнаружено, что чем большее количество сахара используют, тем меньше увеличение размера липосом, получаемых после регидратации, в сравнении с имевшимися на стадии (1). Однако при этом уровень включения реагента может быть ниже. Таким образом, правильный выбор используемых в данном способе коэффициентов указанных соотношений будет зависеть от их целевого использования, при этом необходимо определять нужный баланс между степенью включения реагента при данном содержании липтида и размером липосомы. Разница между этими параметрами находит отражение в определенной вариабельности воздействия конкретного реагента на образование липосом, что будет пояснено ниже. В приемлемом варианте количество имеющегося сахара менее 10% (вес/объем) от всей композиции.

Кроме того, было показано, что увеличение объема используемого в рамках данного способа сахарного раствора при снижении его концентрации может способствовать повышению уровня включения. Приемлемые концентрации растворов сахаров находятся в диапазоне от 20 до 200 мМ, предпочтительно от 30 до 150 мМ.

Далее, было также обнаружено, что если последующую регидратацию проводить при повышенных температурах, например от 30 до 80oС, в частности от 40 до 65oС, и в особенности примерно при 60oС, то уровень включения может быть повышен. Показана эффективность такой процедуры в случае липосом, включающих ФХ и холестерин (ХОЛ), которые обычно образуются при комнатной температуре. Однако при использовании в рамках такого способа повышенных температур может наблюдаться некоторое увеличение размера липосом в сравнении с их исходными значениями, что нужно принимать во внимание при выборе условий, практикуемых для получения липосом в каждом конкретном случае.

К числу других факторов, которые, как было показано, также влияют на уровень включения, относятся индивидуальная природа реагента, такого как инкапсулируемое лекарственное средство, и, в частности, растворимость и количество такого реагента. При этом в некоторых случаях растворимость реагента может лимитировать то его количество, которое может быть растворено на стадии (2) и далее включено в липосому. К числу других факторов, влияющих на количество включаемых реагентов, относятся взаимодействия реагента с липидами липосомы, а также проницаемость липосомы для реагента.

В случае наличия в растворе, используемом на стадии (2) реакции, высоких концентраций реагента процент его включения может быть снижен. В этой связи, по экономическим причинам может быть выгодно снижать количество применяемого реагента.

Условия, выбираемые для целей получения липосом желательных размеров и нагрузки, включают коэффициент отношения массы сахара к массе липида, природу липида, концентрацию используемого раствора сахара, количество включенного в раствор реагента и температуру регидратации, которые могут быть определены для каждого конкретного реагента с помощью обычных процедур.

Указанная выше стадия (3) может проводиться с использованием традиционных способов, например с помощью лиофильной сушки, распылительной сушки, флэш-кристаллизации, высушивания в воздушном потоке (например, в псевдоожиженном слое), вакуумной сушки, сушки в печи или посредством любого другого известного в технике способа. И хотя механические свойства продуктов, получаемых описанными способами, могут различаться, при том что продукт распылительной сушки будет представлять собой дискретный и зачастую текучий порошок, тогда как лиофильная сушка дает твердую лепешку, свойства липосом при регидратации с точки зрения их стабильности и способности к нагрузке реагентом будут в целом сходными.

Распылительная сушка может оказаться предпочтительной для ряда приложений, включая приготовление фармацевтических композиций, поскольку она позволяет получать продукт с приемлемыми для дальнейшей обработки механическими свойствами.

Продукт, получаемый при лиофильной сушке, включает блочную пористую массу, обладающую относительно слабыми механическими характеристиками. С помощью размалывания этой массы ей могут быть приданы лучшие механические свойства, однако имеется риск возникновения повреждений на такой дополнительной стадии.

Распылительная сушка может дать продукт с хорошими механическими характеристиками, который может быть доставлен ингаляцией или введен парентерально после разбавления водой.

Последующая стадия регидратации может быть осуществлена в ходе процесса производства или альтернативно композиция может поставляться в сухом виде и дальше подвергаться регидратации уже в сайте предполагаемого введения, например, в больнице или в фармацевтическом отделении, когда инкапсулированное лекарственное средство должно быть доставлено пациентам.

Образуемые липосомы отличаются хорошей стабильностью, что определяет длительный срок годности продукта. Это свойство важно, например, для косметических продуктов, гигиенических принадлежностей и фармацевтических средств.

Как отмечалось выше, указанный способ особенно хорошо подходит для получения относительно мелких липосом с высокой степенью нагрузки реагентом. Это особенно желательно для применения в фармацевтической области, в частности для доставки материалов, таких как полимерные или белковые лекарственные средства, ДНК-содержащие вакцины, векторы для генной терапии или химические лекарственные средства. Приемлемые химические средства включают антибиотики, такие как окситетрациклины, b-лактамные антибиотики, такие как пенициллины, в частности пенициллин G, ампициллин или амоксициллин, или цефалоспорины, а также противораковые средства, гормоны, иммунотерапевтические препараты, противовирусные средства, противовоспалительные соединения и др.

На основе получаемых с помощью вышеописанного способа липосомных продуктов могут быть приготовлены фармацевтические композиции, например, при объединении их с фармацевтически приемлемыми носителями или наполнителями. Такие композиции могут быть пригодны для целей перорального, парентерального, и, в частности, внутривенного, или местного введения, например, на поверхность кожи или слизистой. Особенно полезной в рамках настоящего изобретения является композиция, пригодная для введения с помощью аэрозольного распылителя или ингалятора. Было обнаружено, что для этой цели приемлемы нейтральные липосомы липидной природы с высоким фазовым переходом, такие как липосомы, образуемые из смесей ДСФХ и холестерина. При осуществлении процесса в соответствии со способом настоящего изобретения, проведение экструзии перед сушкой может стать необязательной процедурой.

Ниже изобретение пояснено с помощью прилагаемых чертежей, при этом:

Рис 8. представляет собой график, демонстрирующий изменение размера дипальмитоилфосфатидилхолиновых (ДПФХ) и холестериновых (ХОЛ) липосом при их обработке ультразвуком и при лиофильной сушке с 0,0357 М сахарозы и затем регидратации;

Рис. 9 представляет собой график, иллюстрирующий влияние молярности раствора сахарозы на распределение размеров ФХ:ХОЛ липосом, включающих FITC-альбумин (% распределения:интенсивность), получаемых после лиофильной сушки и регидратации,

Рис. 10 представляет собой график, демонстрирующий влияние молярности раствора сахарозы на распределение размеров, получаемых после регидратации ФХ:ХОЛ липосом, включающих эпидермальный ростовой фактор (EGF)

Рис . 11 представляет собой график, иллюстрирующий в сравнительном аспекте данные по распределению размеров экструдированных и регидратированных ФХ:ХОЛ липосом, содержащих FITC-альбумин,

Рис . 12 представляет собой график, иллюстрирующий распределение размеров экструдированных и лиофильно высушенных липосом, полученных по способу настоящего изобретения, которые содержат в инкапсулированном виде карбоксифлуоресцеин (КФ);

Рис . 13 представляет собой график, иллюстрирующий распределение размеров различных липосомных композиций

В приведенных ниже примерах фосфатидилхолин яйца (ФХ), дипальмитоилфосфатидилхолин (ДПФХ) и дистеарилфосфатидилхолин (ДСФХ) получают от Липоид ГмбХ (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Germany), холестерин, карбоксифлуоресцеин (КФ), альбумин, меченный флуоресцеинизотиоцианатом (FITC-альбумин), рибофлавин, даунорубицин, доксорубицин, Тритон Х-100, сахарозу, глюкозу и додецилсульфат натрия (ДСН, SDS) получают от компании Сигма (Sigma, Лондон). Эпидермальный фактор роста (ЭФР, EGF) был любезно предоставлен Центром Биологических Исследований, Гавана, Куба (Centre of Biological Sciences). Na125I, С14-меченый гидроксипропил-b-циклодекстрин и С14-меченый пенициллин были приобретены у компании Амершам Интернешнл, Великобритания (Amersham International, Amersham, UK). Мечение ЭФР с помощью 125I выполняют по хлораминатному методу. Все другие реагенты имеют аналитическую степень чистоты.

3.4 Гидрогель липосомные гибриды

Для получения своих липосом-гидрогелевых гибридных пузырьков исследователи адаптировали разработанную специалистами NIST и Университета Мэриленда технологию, известную как COMMAND (COntrolled Microfluidic Mixing And Nanoparticle Determination), в которой используется микроскопическое жидкостное (микрофлюидное) устройство. В новой работе ученых молекулы фосфолипидов растворены в изопропиловом спирте и подаются через тончайший входной канал (21 микрометр в диаметре) в канал-«смеситель», а затем «фокусируются» в струю жидкости водным раствором, подаваемым через два боковых канала. Молекулы предшественника гидрогеля смешены с фокусирующей жидкостью.

В то время как компоненты смешиваются на границе раздела потоков жидкости, происходит самосборка молекул фосфолипидов в нанопузырьки контролируемого размера, захватывающие внутрь находящиеся в растворе мономеры. Вновь образованные пузырьки затем облучаются ультрафиолетовым светом, чтобы полимеризовать находящиеся в них молекулы-предшественники гидрогеля в твердый гель из поперечно-связанных цепочек. Эти цепочки придают прочность пузырькам, позволяя им сохранять сферическую форму конвертов-липосом (что, в свою очередь, способствует проходу всей частицы через клеточную мембрану).

Чтобы превратить гибридный гидрогель-липосомный пузырек в средство адресной доставки лекарственных веществ в опухолевую клетку, нужно добавить лекарство или другой груз к фокусирующей жидкости в процессе производства.

Корпорация "Terumo" совместно с Yakult Honsha Co. Ltd. запустили в производство липосомный комплекс, включающий в себя лекарство против рака. Первая стадия клинических испытаний стартовала в мае этого года в США.

Рис 13 Схематическое изображение образования гидрогель-липосомного гибрида.

Раствор, содержащий фосфолипиды (предшественники липосом), смешиваются с раствором, содержащим молекулы предшественника гидрогеля (а). Смешиваясь на границе раздела двух жидкостей, фосфолипиды образуют липосомы (b), захватывающие внутрь себя молекулы предшественника гидрогеля. Вещество снаружи пузырьков удаляется (с), а липосомы подвергаются воздействию ультрафиолетовым светом. Это полимеризирует белковые цепочки гидрогеля и приводит к образованию гидрогель-липосомного гибрида

Глава 4. Способы активизации липосом как транспортных частиц

4.1 Липосомы, способные к триггерному выходу лекарства: Термо и рН- чуствительные липосомы

Стабилизированные липосомы проникают из сосудов в опухолевые ткани, где в конечном итоге происходит выход лекарства и проникновение его в опухолевые клетки. Процессы, действующие как стимуляторы выхода препарата из липосом, могут включать захват липосом рэтикулоэндотелиальной системой, а также дестабилизацию тканевыми липазами, окисляющими агентами или другими тканевыми компонентами [44]. Новые подходы в создании липосомальных препаратов включают конструирование липосом, способных к триггерному выходу препарата: такие липосомы могут подвергаться структурным изменениям в ответ на физико-химические стимулы, таким образом можно контролировать выход препарата из липосом. Примером таких липосом являются: термочувствительные липосомы, из которых при гипертермии наблюдается выход лекарства, и рН-чуствительные липосомы, триггером которых является кислая среда.

Гипертермия может усиливать накопление в опухоли стабильных и длительно циркулирующих липосом, при этом гипертермия используется и как дестабилизатор термочувствительных липосом, таким образом, обеспечивая выход лекарства в гипертермированный регион. Термолипосомы должны состоять из липидов температурная фаза перехода которых выше 37С. Таким образом, гипертермия индуцирует структурные изменения, приводящие к быстрому выходу инкапсулированного в липосомы препарата. Например, термочувствительные липосомы с доксорубицином были тестированы in vitro на клетках сублинии MCF-7 с МЛУ. При действии на них липосомального доксорубицина и гипертермии клеточный рост был ингибирован на таком же уровне, как и на клетках без МЛУ [87]. При этом наблюдался быстрый выход доксорубицина при 39-40С.

4.2 Комбинация липосом и ингибиторов мембранных транспортеров

Многие агенты способны ингибировать мембранные транспортеры, такие как P-gp, хотя до сих пор нет четких доказательств преимущества этих ингибиторов в клинике. Трудностями в развитии ингибиторов P-gp являются фармакологические ограничения, как самих ингибиторов, так и в комбинации с химиотерапией. Например, PSC 833 (валосподар) аналог циклоспорина и мощный ингибитор P-gp. Хотя этот агент сам вызывает токсичность при использовании его в комбинации с химиотерапевтическими препаратами, такими как даунорубицин, доксорубицин и паклетаксел, наблюдается значительное изменение в клиренсе и фармакокинетике химиотерапевтических лекарств, приводящее к усилению токсичности [12]. В предклинических исследованиях комбинация PSC 833 с липосомальным доксорубицином была предпочтительнее, чем со свободным препаратом, поскольку он предотвращал нежелательное взаимодействие между лекарствами, пегилированный липосомальный доксорубицин был не затронут PSC 833. Липосомальная доставка может уменьшать определенные фармакологические сложности, связанные с сопутствующей антирезистентной терапией, путем включения антирезистентных агентов в липосомы. В ранних исследованиях в липосомы упаковывали ингибитор P-gp валиномуцин, который сам обуславливал значительную токсичность. Липосомальный валиномуцин давал меньшую токсичность без уменьшения ингбиторной активности для P-gp в экспериментальных моделях [40].

4.3 Доставка аналогов гидрофобных лекарств

Липосомы могут также использоваться для доставки аналогов гидрофобных лекарств, предназначенных для предотвращения резистентности, опосредованной мембранными транспортерами. Например, антрациклин -аннамицин и липофильное производные платины [105]. Эти соединения предназначены для того, чтобы сделать клеточный захват относительно независимым от P-gp и/или других выбрасывающих лекарства насосов. Хотя липосомальный аннамицин, проявил активность в предклинических исследованиях на моделях с лекарственной резистентностью, во II фазе клинических исследований липосомальный аннамицин никаких ясных доказательств эффективности у пациентов с раком молочной железы, резистентных по доксорубицину не показал [24].

4.4 Использование липосомальных векторов в генной терапии

Существуют различные подходы генной терапии для ингибирования, преодоления или использования механизмов резистентности. Прогресс в этой области и в генной терапии опухолей в настоящее время ограничен недостаточным развитием генно-векторной технологии для доставки нуклеиновых кислот. Для вирусных векторов характерны: канцерогенность, токсичность, иммуногенность, не специфичность, низкая экспрессия вирусных рецепторов на опухолевых клетках, а также сложная процедура создания. Использование липосомальной системы доставки более дешево. Однако эти системы опираются в основном на катионные липиды/липосомы для упаковки нуклеиновых кислот, которые являются более стабильными, чем нейтральные липосомы, созданные для эффективной длительной циркуляции. Конструкции, содержащей ген, необходима стабильность для проведения успешной генной терапии, более того, добавление фрагментов антител или других лигандов к конструкции может позволить сделать генную доставку более специфичной и эффективной.

Генная терапия на основе липосом включает подходы, при которых возможно прямое воздействие на механизмы лекарственной резистентности [71, 104]. Например, использование катионных липосом для доставки антисмысловых олигонуклеотидов или рибозимов против сиквенсов MDR1 гена, а также использование технологии генной терапии для гиперэкспресси генов лекарственной резистентности в нормальных тканях, для защиты тканей от токсического действия химиотерапии [123, 15, 83]. Например, ген MDR1 трансфецированный посредством липосомальных векторов в гематопоэтические предшественники в костном мозге [14].

Олигонуклеотиды сконструированы для того, чтобы смодулировать передачу генетической информации, но механизмы, с помощью которых олигонуклеотиды могут индуцировать биологический эффект, сложны. Для того чтобы антисмысловые олигонуклеотиды снижали экспрессию гена, он должен проникнуть в клетки мишени. Данные о точных механизмах, вовлеченных в этот процесс не ясны. Захват происходит через активный транспорт, который в свою очередь зависит от температуры, структуры и концентрации олигонуклеотидов и линии клеток [78, 128, 135]. Многочисленными работами было продемонстрировано, что олигонуклеотиды плохо интернализуются в клетках вне зависимости от того отрицательно они заряжены или нет, а также обязательным условием для действия антисмысловых олигонуклеотидов является, по-видимому, их ядерная локализация [54, 22]. Для того чтобы улучшить клеточный захват и активность антисмысловых олигонуклеотидов используют транспортеры, такие как липосомы. Использование этих транспортеров позволяет увеличить стабильность олигонуклеотидов от разрушения нуклеазами и позволяет использовать их меньшие концентрации .

Нуклеиновые кислоты могут легко инкапсулироваться в липосомы, которые содержат водное пространство, либо могут быть связанными с липосомальной поверхностью электростатическими взаимодействиями. Эти векторы, из-за их положительного заряда, имеют высокую аффинность к мембранам клеток, которые отрицательно заряжены при физиологических условиях [119].

Вс1-2 - важный антиапоптотический белок, который определяется в различных человеческих опухолевых клетках. Его ингибирование может теоретически вызывать чувствительность клеток к цитотоксической химиотерапии, что было показано в ряде последних исследований на тканевых культурах и экспериментальных моделях, которые привели к началу клинических испытаний [59].

Гиперэкспрессия Вс1-2 наблюдается при многих видах новообразований. Вс1-2 повышен приблизительно в 35% опухолей у больных раком предстательной железы [86, 21]. При гиперэкспрессии белка bcl-2 в опухолевых клетках простаты LNCaP увеличивался их in vivo туморогенный потенциал и появлялась резистентность к апоптозу [108]. Экспрессия Вс1-2 в нормальных эпителиальных клетках предстательной железы является низкой или отсутствует.

Первоначально, антисмысловые фосфодиестер и фосфоротиоат олигонуклеотиды к мРНК bcl-2, использовались для ингибирования роста клеток в культуре 697 человеческой лейкемии [112]. Мишенью олигонуклеотидов является сайт инициации трансляции человеческого мРНК bcl-2. Оба класса олигомеров уменьшают клеточную пролиферацию: фосфоротиоаты более сильные ингибиторы, эксперименты с фосфодиестером в настоящее время потеряли свою значимость. Предполагалось, что фосфоротиоат bcl-2 антисмысловые олигонуклеотиды индуцируют клеточную гибель через взаимодействие со специфическими участками [26, 45].

Препарат G3139, представляющий собой фосфодиестер и фосфоротиоат антисмысловые олигонуклеотиды, направленные против первых шести кодонов Bcl-2 мРНК (G3139, Genta, Inc., Lexington, Mass.), был успешно использован на клетках Неходжскинской лимфомы. Молекулярная масса G3139 - 579,99. Он нестабилен в растворах со значением рН менее 3 или выше 7. Предполагаемое специфическое уменьшение уровня Вс1-2 мРНК через один день после обработки было продемонстрировано Kitada и соав. в клетках SU-DHL-4 [69]. Соизмеримое уменьшение в уровне белка Вс1-2, наблюдалось только после трех дней, по-видимому, из-за длительного периода жизни белка Вс1-2, что было связано с сильным снижением клеточной жизнеспособности. Обработка клеток лимфомы RS11846 препаратом G3139 приводила к уменьшению экспрессии Вс1-2 и увеличени. чувствительности этих клеток к АгаС и метотрексату [70]. При этом использовалась чрезвычайно высокая концентрация олигонуклеотидов.

Обработка опухолевых клеток LNCaP и опухоли Шионоги in vitro G3139 ингибировала экспрессию Вс1-2, что зависело от дозы и специфичности последовательностей [50, 89]. Авторы использовали катионный липид липофектина для доставки и измеряли уровни bcl-2 белка и мРНК. Однако они использовали только одиночный контроль олигонуклеотида, который уменьшает достоверность эксперимента. В других экспериментах, антисмысловые олигонуклеотиды существенно усиливали чувствительность к паклитакселу и доцетакселу, причем усиление действия препаратов зависело от их дозы. Характерные апоптотические изменения были обнаружены только после комбинированного лечения, а не после использования одного Вс1-2 олигомера [37, 51].

В настоящее время фосфоротиоат олигонуклеотиды (G3139) изучаются при введении внутривенно или интроперитонеально у пациентов, которые принимают участие в клинических испытаниях [13, 60]. Эти олигонуклеотиды стабильны в течение 48 часов, к этому времени их уровни все еще могут определяться в тканях. После внутривенного введения G3139 в дозе приблизительно 5 мкг/кг, элиминация в плазме составляет 22ч [34, 35, 111, 133].

Данные клинических исследований дают основания для дальнейшего клинического развития G3139, как монотерапии, так и в комбинации с другими цитотоксическими препаратами [29, 36, 64, 65, 91, 130, 131]. G3139 в настоящее время проходит I/II фазы испытаний у пациентов с андроген-независимым раком предстательной железы, которым назначают G3139 в комбинации с доцетакселом. Клинические испытания других нозологии опухолей планируются [29, 91]. Эффективность этого препарата в клинике в настоящее время обнадеживает, так как его токсичность относительно низкая, состоит, главным образом, в утомлении и тромбоцитопении.

Глава 5. лекарственные препараты на основе липосом

При парентеральном введении распределение липосом в организме зависит от состава липосомальной мембраны, их размера, заряда, других химических и физических параметров везикул и иммобилизованных в них веществ, а также от способа введения. Так, например, после подкожного введения большинство липосом депонируется в месте введения и элиминируется оттуда преимущественно лимфогенным путем. Таким образом, местное введение липосомальных препаратов является оптимальным способом их доставки в регионарные лимфоузлы.

При внутримышечном введении липосомы способны создавать депо препарата в месте введения, скорость элиминации из депо зависит от размера и свойств липосом и составляет от нескольких часов (мелкие липосомы) до нескольких дней (крупные). Мелкие бислойные липосомы в отличие от крупных при внутрибрюшинном или внутримышечном введении гораздо быстрее проникают в кровеносное русло, что указывает на ограниченную способность последних проходить через капилляры и мембраны сосудов. При внутривенном введении мелкие липосомы выводятся из кровотока медленнее, чем крупные.

Для повышения тропности липосом к определенным органам и тканям их изготавливают из фосфолипидов, изолированных из этих органов, или фиксируют на поверхности специфические антитела против соответствующих тканевых антигенов, или применяют так называемые молекулы-посредники, обладающие двумя типами сродства: к клеткам макроорганизма и к липосоме. При необходимости локального воздействия на клинический процесс для исключения системного влияния на организм целесообразно местное применение лекарственных препаратов.

Липосомальные препараты по сравнению с такими традиционными лекарственными формами для наружного применения, как мази и гели, обладают большей способностью проникать в кожу и волосы, поэтому они более доступны для живых клеток-мишеней. Установлено, что липосомы интенсифицируют процессы взаимодействия активных веществ с кожей при лечебной наружной терапии, что повышает терапевтическую эффективность иммобилизованных в них лекарственных веществ. Скорее всего, такой эффект обусловлен слиянием липосом с липидными ламеллами вне базального слоя и высвобождением их внутреннего содержимого. Подвижные липиды липосом встраиваются в липидные ламеллы, увеличивая таким образом «жидкостность» барьера, что улучшает его проницаемость. Другим важным путем проникновения липосом и их содержимого вглубь кожи являются волосяные фолликулы. Эффективность трансдермального липосомального переноса лекарственных веществ можно усиливать с помощью методов ионо- и фонофореза

5.1 Фосфоглив- оригинальный препарат российских технологий

Фосфоглив - оригинальный гепатопротективный препарат на основе фосфатидилхолина (фосфолипид) растительного происхождения (из семян сои) и тринатриевой соли глицирризиновой кислоты из корня солодки.

Фосфоглив разработан в ИБМХ РАМН, как усовершенствованный аналог выпускаемого фирмой Nattermann Internetional GmBH, Germany препарата Эссенциале, используемого для лечения заболеваний печени.

Фосфолипиды являются основным структурным компонентом всех клеточных мембран. При препоральном введении в организм фосфолипиды воостанавливают целостность мембран клеток, в первую очередь печени - гепатоцитов.

Глицирризиновая кислота обладают широким спектром биологической активности, противовоспалительными свойствами, применяются для лечения заболеваний печени токсического и вирусного происхождения, в том числе и гепатита С. За счет детергентного действия обеспечивает эмульгирование фасфатидилхолина в кишечнике.

Сочетание этих двух компонентов делает фосфоглив особенно эффективным при лечении печени.

На протяжении нескольких последних десятилетий «эссенциальные» фосфолипиды являются ведущими препаратами в лечении алкогольной болезни печени и широко применяются в России. Препараты этой группы известны врачам и пациентам и вошли во все отечественные руководства по клинической фармакологии [12].

Основная роль фосфолипидов сводится к восстановлению структуры и функций поврежденных клеточных мембран. Предотвращая потерю клетками ферментов и других биологически активных веществ, фосфотидилхолин, составляющий основу в структуре фосфолипида, нормализует белковый и жировой обмены, восстанавливает детоксицирующую функцию печени, ингибирует процессы формирования соединительной ткани, тем самым снижая интенсивность развития фиброза и цирроза печени. Кроме того, доказано, что алкоголизм служит благоприятным условием для широкого распространения вирусных гепатитов, которые на его фоне имеют более тяжелое течение и неблагоприятные исходы [13].

Авторами было выявлено, что терапия Фосфогливом пациентов с «акогольной болезнью» сокращает сроки пребывания в реанимационном отделении стационара на 16%, а следовательно, уменьшает и затраты на лечение данной категории больных.

Фосфатидилхолин (действующее вещество фосфолипидов) является основным структурным элементом клеточных и внутриклеточных мембран, способен восстанавливать их структуру и функции при повреждении, оказывая цитопротекторное действие. Нормализует белковый и липидный обмены, предотвращает потерю гепатоцитами ферментов и других активных веществ, восстанавливает детоксицирующую функцию печени, ингибирует формирование соединительной ткани, снижая риск возникновения фиброза и цирроза печени.

Глицират (глицирризиновая кислота и соли) обладает противовоспалительным действием, подавляет репродукцию вирусов в печени и других органах за счет стимуляции продукции интерферонов, повышения фагоцитоза, увеличения активности естественных клеток-киллеров. Оказывает гепатопротекторное действие благодаря антиоксидантной и мембраностабилизирующей активности. Потенцирует действие эндогенных глюкокортикостероидов, оказывая противовоспалительное и противоаллергическое действие при неинфекционных поражениях печени.

5.2 Липосом-форте –препарат для применения в неврологической практике

Активное действующее вещество: фосфолипиды гипоталамуса (общее название активного ингредиента) в ампулах по 2 мл содержит: Гипоталамуса фосфолипиды 28 мг.

Вспомогательные вещества: Маннитол, натрия фосфат двузамещенный додекагидрат, фосфат натрия дигидрофосфат дигидрат, эфир п-гидроксибензойной кислоты, вода для инъекций.

Форма выпуска: Раствор для в.м. / в.в. инъекций (внутримышечных или внутривенных инъекций) - № 5ампул по 2мл.

Показания: Терапия метаболической аномалии в результате церебрального нейроэндокринного расстройства. И как вспомогательное средство при болезни Паркинсона и синдромов паркинсонизма.

5.3 Другие препараты,применяемые в медицине

Торговое название	Международ-ное название	Фирма- производитель или разработчик препарата	Форма выпуска и доза	Примечания. Состав для комбинированных препаратов
1	2	3	4	5
Фосфолип	Лецитин	Universal medicare (Индия)	Kапсулы 0,35 г
Липин*	Липин*	«Биолек», Украина, Харьков	Лиофилизированный порошок во флаконах для приготовления р-ра для инъекций или ингаляций	При суспендировании в воде образует липосомы
Мега-Липин	Фосфатидил холин	Mega Pharmaceutical (Германия-Ирландия)	Порошок во флаконах для приготовления р-ра для ингаляций или в/в введения; 0,5 г во фл. 50 мл.	Обладает антигипоксическим, муколитическим и бронхолитическим действием.
Эссенциале	Эссенциале*	Rhone-Poulenc Rorer (США/Франция), Natterman (Германия)	Р-р для инъекций, капсулы	Эссенциальные фосфолипиды, комплекс витаминов гр. В, РР, Е, ненасыщенные жирные кислоты
Лиолив		KНИФТ АМН Украины, УкрФА, «Биолек», Харьков	Лиофилизированный порошок во флаконах для приготовления р-ра для инъекций или перорального приема	Kомплексное соединение, содержащее мефенаминат алюминия, заключенный в липосомы липина.
Липофен		ГНЦЛС, Харьков	Kапсулы	Эссенциальные фосфолипиды, витамины В1, В6 и Е, флакумин.

Доля фосфолипидных препаратов в общей номенклатуре «истинных» гепатопротекторов

Амфотерицин В (АмВ) используется в клинической практике с 1959 года. Долгое время он являлся единственным препаратом для терапии тяжелых инвазивных микозов. Сейчас основной причиной применения АмВ в качестве препарата второго ряда или препарата резерва является его нефротоксичность и высокая частота инфузионных реакций. Липосомальные формы амфотерицина В, в частности липидный комплекс АмВ, липосомальный АмВ и коллоидная дисперсия АмВ, не имеют нежелательных реакций такого рода.

В статье, опубликованной в журнале Clinical Infectious Diseases, Ostrosky-Zeichner L. и соавт. попытались обосновать точку зрения о том, что липосомальные формы амфотерицина В ничем не уступают по своей эффективности и превосходят по своей переносимости обычный амфотерицин В, в связи с чем есть основания рекомендовать данные формы препарата в качестве препаратов выбора для большинства системных грибковых инфекций.

В исследованиях in vitro в отношении криптококка, грибов рода Candida и некоторых мицелиальных грибов были показаны более высокие показатели МПК и минимальной фунгицидной концентрации для всех липосомальных форм амфотерицина В. Однако данный факт можно связать с более трудным высвобождением активного препарата из липидных молекул, что направлено, в первую очередь, на фармакокинетические превращения препарата в организме, в связи с чем данные, полученные in vitro, трудно сопоставить с показателями клинической эффективности. Это обуславливает необходимость поиска новых путей определения активности in vitro липосомальных форм амфотерицина В в отношении различных видов грибов.

В настоящее время проведено достаточное количество многоцентровых сравнительных рандомизированных клинических исследований, позволяющих с уверенностью говорить, по крайней мере, об эквивалентной эффективности липосомальных форм амфотерицина В по сравнению с обычной формой препарата, в первую очередь, в плане выживаемости пациентов. Некоторые исследования продемонстрировали значительно более быстрый ответ на терапию липосомальными формами, в частности, при криптококковом менингите (Leenders и соавт.). Наиболее показательным исследованием можно считать многоцентровое двойное слепое рандомизированное исследование, проведенное Walsh и соавт. В нем сравнивался обычный и липосомальный амфотерицин В при лечении пациентов с нейтропенической лихорадкой. В итоге оба препарата показали одинаково хорошую эффективность, но использование липосомального амфотерицина В сопровождалось меньшим числом нежелательных лекарственных реакций. При сравнительном исследовании обычного амфотерицина В и его коллоидной дисперсии при инвазивном аспергиллезе (Bowden и соавт.) оба препарата продемонстрировали одинаковую клиническую эффективность, однако частота развития нефротоксичного действия при использовании коллоидной дисперсии амфотерицина В была в 3 раза реже (12% vs 38%).

Таким образом, липосомальные формы амфотерицина В в настоящее время вполне могут рассматриваться как препараты выбора для терапии системных грибковых инфекций с возможностью использования широкого диапазона дозировок от 3 мг/кг/сут при инфекциях Candida spp., до 6 мг/кг/сут при криптококкозе или микозах, вызванных мицелиальными грибами. Они должны полностью заменить обычный амфотерицин В в тех случаях, когда его использование опасно в силу высокого риска развития у пациента нефротоксичности или инфузионных реакций. Однако для выбора оптимальной липосомальной формы АмВ и наиболее подходящего режима дозирования при различных формах инвазивных грибковых инфекций потребуется проведение дальнейших клинических исследований.

5.4 Липосомы в дерматологии

Проблема проницаемости кожи весьма выпукло предстает перед нами при обсуждении липосомальных кремовых композиций. Липосомальная частица классическом варианте представляет собой сферическую структуру

Небольшой объем водного раствора, содержащего вещество А, отделен от окружающей среды бислойной липидной мембраной, состоящей из соевого или яичного лецитина с включением других липидов - фосфатидилсерина, фосфатидилэтаноламина, холестерина и т. д. Молекулы лецитина и других фосфолипидов имеют полярную "головку", обладающую высокой гидрофильностью (сродство к воде), и липофильные фрагменты жирных кислот (липофильный "хвост"). Полярные "головки" молекул фосфолипидов внутреннего слоя мембраны регулярным образом направлены в сторону внутреннего водного раствора, в то время как липофильные "хвосты" наружного и внутреннего слоев бислойной мембраны взаимодействуют друг с другом (подобное растворяется в подобном).

Липосомальные формы препаратов создаются специально для доставки биологически активных веществ к клеточным системам организма. Допустим, какой-нибудь медицинский препарат пептидной природы при введении в кровеносную систему не успевает достичь мелких капилляров, то есть претерпевает превращение под действием ферментов крови (например, протеаз). Или, например, каким образом сохранить (доставить в кровь) такой препарат как интерферон, являющийся пептидом, при его введении через желудочно-кишечный тракт? Поэтому возникла оригинальная идея - защитить медицинский препарат двуслойной липидной мембраной. Таким образом, основное действующее начало липосомальных препаратов должно содержаться внутри липосомы (в водном растворе). Такая липосомальная частица, мигрируя по кровеносному руслу или попадая в желудок человека и испытывая на себе действие желудочного сока и ферментов, может быть, даже постепенно "раздеваясь" и теряя бислойную мембрану, увеличивает время жизни медицинского препарата и повышает вероятность его доставки к клеточным системам организма.

Можно себе представить также ситуацию, когда липосомальный фрагмент, завершив путь по кровеносному руслу, в конечной капиллярной петле вытекает вместе с плазмой крови в межклеточную жидкость и соприкасается с клеточной мембраной. Так как двухслойная мембрана липосомальной частицы имеет сродство (аналогична) клеточной мембране, то может произойти их слияние и внутреннее содержание липосомы как бы впрыскивается внутрь клеток.

Стилизованное изображение слияния липосомальной частицы с клеткой

Естественно, что результатом взаимодействия липосомальной частицы с клеткой будет не только процесс слияния. Рассматриваются и другие возможные варианты взаимодействия: адсорбция на клеточной поверхности, обмен липидов с клеточной мембраной, захват липосом без разрушения в ходе эндоцитоза (см., например, [22]).Однако можно полагать, что эти варианты либо предшествуют слиянию, либо при рассмотрении брутто-процесса результатом взаимодействия является появление в клеточном цитозоле веществ, вводимых в липосомы.

Достоверно установлена практическая необходимость использования липосомальных форм медицинских препаратов. В качестве примера можно привести запатентованную сотрудниками Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" липосомальную форму препарата "Реаферон", позволяющую вводить этот генно-инженерный аналог интерферона в организм человека перорально без заметного снижения активности.

В отличие от медицинских косметические препараты наносятся только на поверхность кожи, и поэтому важнейшим вопросом является способность липосомальных частиц преодолевать трансэпидермальный барьер. Современная технология производства липосом позволяет получать частицы с размерами не ниже 100 нм. Обычно размеры липосом колеблются от 200 до 600 нм. Однако эти значения в десятки раз превышают размеры вирусов, в том числе и оболочечных, окруженных липидной мембраной, не способных проникать через неповрежденную кожу (см. выше). Поэтому трудно представить себе механизм преодоления гигантской липосомальной частицей микрокапилляров рогового и блестящего слоев эпидермиса. Разработчики липосомальных косметических препаратов полагают, что липосомальная частица обладает способностью деформировать свою структуру в процессе преодоления микрокапилляров (см. рис.15).

Рис15. Схематическое изображение "способности" липосомальной частицы деформировать структуру в процессе преодоления микрокапилляра

Попробуем оценить вероятность такого события. Предположим, что исходная липосомальная частица (Лисх) имеет средний диаметр около 400 нм. Объем частицы сферы при этом составит

примерно 33,5·106 нм3. После деформации частицы за счет размещения её в микрокапилляре объем деформированной частицы цилиндра может быть выражен в соответствии с формулой

,где Rдеф является радиусом отверстия микрокапилляра, а L - длина цилиндра. Так как мы исходим из предположения о том, что липосомальная частица при внедрении в микрокапилляр не разрушается, то Vисх=Vдеф. Отсюда

Принимаем, что радиус микрокапилляра составляет примерно 5 нм, тогда

Полученное значение более чем в 20 раз превышает толщину рогового слоя и примерно в десять раз - суммарную толщину рогового и блестящего слоев эпидермиса. Это означает, что, извиваясь в виде своеобразного "червячка" (повторяя изгибы микрокапилляров), деформированная липосомальная частица (Лдеф) должна заполнить смежные микрокапилляры рогового и блестящего слоев и, при этом, часть липосомального фрагмента или останется на поверхности кожи, или проникнет в зернистый, шиповидный слои эпидермиса и далее. У нас нет фактов, которые могли бы подтвердить или опровергнуть возможность реализации такого механизма преодоления трансэпидермального барьера. Отметим, однако, что для его реализации требуется, чтобы бислойная липидная мембрана липосомы имела высокую эластичность и прочность.

Аналогичным образом рассмотрим вероятность размещения Лдеф в микрокапилляре, имеющем радиус около 5 нм с учетом толщины удлиненной частицы. Если диаметр Лдеф равен диаметру микрокапилляра с ориентировочным значением 10 нм, то на этом расстоянии необходимо разместить две бислойные липидные мембраны и при этом между ними должен остаться промежуток для размещения внутрилипосомального водного раствора и для предотвращения слипания мембран, которое, в принципе, может вести к дроблению липосомальной частицы на более мелкие фрагменты. Принимая во внимание, что фосфолипиды, образующие бислойные мембраны, имеют длинноцепочечные жирнокислотные "хвосты", состоящие из 16-22 метиленовых (СН2) фрагментов, можно ориентировочно оценить толщину бислойной мембраны. Учитывая то обстоятельство, что длина ординарной связи С-С составляет примерно 1,54 A (или 0,15 нм), а двойной связи С=С - примерно 1,42 A (или 0,14 нм) и углы между атомами углерода в жирнокислотном фрагменте равняются 109° (для насыщенных связей) и 120° (для ненасыщенных связей), толщина бислойной мембраны составит около 5-6 нм. Следует отметить условности такого рода расчетов, так как, например, ранее при обсуждении строения чешуек рогового слоя приводилась толщина однослойной мембраны, равная 12-15 нм. А ведь нам необходимо разместить в микрокапилляре с диаметром около 10 нм две такие бислойные мембраны и сохранить пространство для размещения внутрилипосомального водного раствора. Эти достаточно простые арифметические расчеты, которые, конечно, грешат некоторой неточностью, указывают, тем не менее, на возможные затруднения в объяснении механизма преодоления трансэпидермального барьера липосомальными частицами. Не затрагивая деталей этого механизма, связанных с возможностью деформации бислойной мембраны по толщине под внешним воздействием, а также экспериментально установленный факт слияния двух липидных мембран при их сближении, можно сформулировать парадокс, связанный с механизмом транспорта липосом через неповрежденную кожу.

В дискуссиях об "особом статусе" липосомальных косметических препаратов часто возникает вопрос о том, почему они нашли такое широкое распространение и почему очень известные и, несомненно, уважаемые косметологические фирмы считают своими долгом выпускать такого рода косметику

В водных системах, содержащих вещества, способные образовывать липидные мембраны, возможно два варианта ассоциации этих веществ. Один вариант связан с образованием "истинных" липосом Другой вариант ассоциации липидов в водной системе может быть связан с образованием, так называемых, наносом (nanosomes, niosomes и т.д.), которые представляют собой мельчайшие сферы, состоящие из липидов, не имеющие, в отличие от липосом, внутреннего водного резервуара и отделенные от внешней водной среды монослойной липидной мембраной Образование таких частиц, по-видимому, является энергетически оправданным, так как необходимость структурирования (снижения энтропии системы) проявляется только в организации поверхностного ламинарного монослоя, в то время как внутренние молекулы, содержащиеся в сфере, располагаются хаотично.

Схематическое изображение наночастицы (наносомы)

Можно полагать, что наночастицы образуются при интенсивном физическом воздействии на липосомальные структуры (например, с помощью ультразвука) и что вероятность их образование увеличивается при увеличении относительного содержания липидов (жиров) в исходной системе, предназначенной для получения везикул (пузырьков) и/или липидных сфер. На рисунке схематично представлен предполагаемый постадийный процесс образования липосом и наночастиц.

Возможная схема образования липосом и наночастиц в процессе обработки липидно-водных систем ультразвуком

Принимая такую схему, учитывающую то обстоятельство, что наночастицы могут образовываться при разрушении липосомальных частиц, а также приведенные выше рассуждения о возможных размерах липосомальных фрагментов следует предположить, что диаметр наночастиц может быть принципиально более низким.

Часто разработчики косметических препаратов объединяют липосомы и наночастицы под одним обозначением - "везикулы". Так в патенте фирмы Л`Ореаль [24] говорится о том, что везикулы обычно имеют средний диаметр между 10 и 5000 нм. Однако нам неизвестны случаи строгого доказательства того, что липосомы (собственно "везикулы" - пузырьки) имели бы размеры меньше 100 нм (обычно их диаметр не ниже 300 нм). А вот липидные сферы (наночастицы) могут иметь диаметр около 10 нм.

Основная суть цитируемого патента заключается в том, что авторы получают либо одновременно, либо в отдельности два вида частиц. Первая категория - это липосомы, предназначенные для доставки активного агента в глубокие слои кожи, а вторая категория - липосомы для доставки в поверхностные слои кожи. Для обеих категорий препаратов были определены следующие сравнительные характеристики:

- глубина проникновения активного агента;

- потенциал инкапсуляции.

Глубина проникновения активного агента определялась посредством использования органического вещества, которое находилось в свободно-радикальном состоянии и его присутствие в тех или иных слоях кожи (ухо свиньи) определялось с помощью известного метода электронного парамагнитного резонанса. Следует заметить, что вещество (N-(1-оксил-2,2,6,6-тетраметил-4-пиперидил)-N,N-диметил-N-гидроксиэтиламмоний иодид), обладало амфотерными свойствами, то есть имело сродство к полярным молекулам, например, к воде, а наличие углеводородного цикла с четырьмя метильными фрагментами могло определять его сродство к липидам. Кроме этого, биофизические исследования свидетельствуют, что чем меньше диаметр сферы, верхний слой которой образован из регулярно расположенных полярных групп, тем прочнее образующиеся в процессе сольватации на поверхности сферы ионные пары и, наоборот, для больших сфер прочность связывания полярных молекул (ионов) с поверхностью снижается.

Поэтому установленная авторами разработки предельная величина константы диффузии (>1·10-7cм2с-1) может относиться к новому состоянию системы, включающему большое количество липидных сфер (наночастиц). Такие частицы, вне всякого сомнения, более подвижны по сравнению с липосомами и их проникающая способность достаточно высока, что и фиксируется экспериментами с меткой, которая, как уже отмечалось выше, с одной стороны, обладает определенной липофильностью, а с другой стороны, способна образовывать достаточно прочную (ионную и/или водородную) связь с поверхностью сферы.

Остается объяснить приводимые авторами данные по инкапсулированию глюкозы. Степень инкапсулирования измеряется количеством раствора глюкозы, инкапсулированного в "везикулах" (это могут быть как липидные сферы, так и липосомы), измеряемого в мкл на единицу веса липидов, составляющих мембрану (или входящих в состав сфер). Ее определяют немедленно после отделения свободной глюкозы (не вошедшей в капсулы), а также спустя 24 часа после отделения. Разность между этими двумя последовательными измерениями иллюстрирует проницаемость (а скорее стабильность) капсул и может считаться их потенциалом инкапсулирования (или потенциалом стабильности). Естественно, что и абсолютные величины степени инкапсулирования (хотя при этом нужны точные данные по исходной концентрации глюкозы в обоих экспериментах), и потенциалы инкапсулирования (или потенциал стабильности для капсул малого размера) оказались более высокими, чем для капсул большего размера. А теперь рассмотрим сродство молекул глюкозы к ингредиентам, входящим в состав капсул, используемым разработчиками фирмы Л`Ореаль. В патенте представлены десять вариантов везикул, доставляющих активный агент в глубокие слои кожи (авторы называют их липосомами). В их составах содержатся триглицерилцетиловый эфир, смесь монотриглицерин-, ди- и трицетиловых эфиров, холестерин, сорбитана пальмитат, ПЭГ 8 стеарат, ПЭО5 фитостерола, дистеарат полиоксиэтилен(20)метилглюкозы, диглицерилдистеарат, моно- и дистеараты сахарозы, тетреглицерилтристеарат. Простое перечисление этих ингредиентов, даже для неподготовленного читателя, позволяет сделать вывод о том, что глюкоза, являющаяся многоатомным спиртом (полиолом) имеет высокую степень сродства с указанными ингредиентами, содержащими большое число гидроксильных групп. В отличие от этого, основной "липидной" составляющей везикул второй группы является лецитин, концентрация которого варьирует от 100 до 20% или димиристилфосфат (95%). Эти вещества, способные образовывать бислойные липидные мембраны, образуют липосомы. При этом местом локализации глюкозы может являться внутренний водный резервуар липосомы, а также ее поверхность, с полярными группами которой возможно образование нестабильных водородных связей.

Таким образом, приведенные авторами работы [24] результаты исследований не могут опровергнуть предположение о том, что в случае препаратов, способных доставить вещество в глубокие слои кожи, они имели дело с наночастицами, в структуру которых и встраивалось активное вещество (будь это радикальная метка или глюкоза). В другом варианте они имели дело с весьма нестабильными липосомальными образованиями, не способными доставить свое содержимое в нижние слои кожи.

Итак, это наночастицы - и не просто наночастицы, а системы, содержащие вещества, способствующие повышению проницаемости кожи или так называемые энхансеры. И, если внимательно взглянуть на текст патента [24], то, вообще-то говоря, вы не найдете здесь доводов в пользу того, что авторы в случае высокоэффективных препаратов имели дело действительно с наночастицами, а не с обычной кремовой композицией, содержащей указанные ингредиенты. Вот что говорят об этом сами авторы: "Везикулы первой категории, так называемые везикулы глубокого действия, обычно находятся в жидком состоянии, при комнатной температуре обычно находятся в состоянии геля"

Выводы

Как известно, липиды — гидрофобные соединения, то есть соединения, отталкивающие от себя молекулы воды; они являются одним из основных компонентов биологических клеточных мембран, создающих в организме энергетический резерв, а также способных образовывать защитные покровы. Свойства липосом и их поведение определяются прежде всего наличием у них замкнутой мембранной оболочки. Несмотря на молекулярную толщину (около 4 нм), липидный бислой отличается исключительной механической прочностью и гибкостью. Благодаря этому липосомы сохраняют целостность при различных повреждающих воздействиях, а их мембрана обладает способностью к самозалечиванию возникающих в ней структурных дефектов. Кроме того, гибкость бислоя и его текучесть придают липосомам высокую пластичность.

Для практического применения липосом и везикул исключительно важна их способность включать в себя и удерживать вещества различной природы. Круг веществ, включаемых в липосомы, необычайно широк — от неорганических ионов и низкомолекулярных органических соединений до крупных белков и нуклеиновых кислот. Первое применение липосом в научных исследованиях было связано с использованием липосом в качестве транспортного средства для доставки лечебных агентов в живую ткань. В 1971 г. была предпринята попытка замыкания в липосомах ферментов с последующим введением везикул в кровоток для коррекции метаболических нарушений в печени при гликогенозе. В дальнейшем разрабатывались липосомальные формы ряда противоопухолевых препаратов, комплексонов, антибиотиков, гормонов. Благодаря наличию в липосомах двухслойных мембран они могут использоваться для транспортировки как гидрофильных, так и гидрофобных лекарственных веществ. Липосомы малотоксичны и легко подвергаются биодеградации в отличие от полимерных систем с контролируемой доставкой лекарственных средств.

В настоящее время липосомальная терапия — одно из наиболее активно развивающихся направлений в фармакологии и медицине. Способность липосом включать в себя самые разные вещества практически без каких-либо ограничений в отношении их химической природы, свойств и размера молекул дает поистине уникальные возможности для решения некоторых медицинских проблем. Так, многие лекарственные препараты имеют низкий терапевтический индекс. Это означает, что концентрация, в которой они оказывают лечебное действие, мало отличается от концентрации, при которой препарат становится токсичным. В других случаях лекарственный препарат при введении в организм может быстро терять активность. Включение таких препаратов в липосомы может значительно повысить их терапевтическую эффективность, поскольку, с одной стороны, препарат, находящийся в липосоме, защищен ее мембраной от действия неблагоприятных факторов, а с другой — та же мембрана не позволяет токсичному препарату превысить допустимую концентрацию в биологических жидкостях организма. Липосома в данном случае выполняет роль хранилища, из которого препарат высвобождается постепенно, в нужных дозах и в течение требуемого промежутка времени.

С точки зрения биологической совместимости липосомы идеальны как переносчики лекарственных препаратов. Они изготавливаются из природных липидов и поэтому нетоксичны, не вызывают нежелательных иммунных реакций и биодеградируемы, то есть должны разрушаться под действием обычных ферментов, присутствующих в организме.

В настоящее время большие возможности открываются в отношении активного «адресования» липосомальных форм лекарственных веществ органу-мишени с помощью различных, в том числе физических воздействий — тепло, ионизация и т.д. Уникальной особенностью липосом является возможность доставки лекарственных препаратов внутрь клеток, с которыми они взаимодействуют путем слияния или эндоцитоза. Модифицируя мембрану липосом молекулами, обеспечивающими «узнавание» клетки или органа-мишени, можно осуществлять направленную транспортировку лекарств. Это обусловливает использование липосомальных форм препаратов для лечения внутриклеточного паразитизма (липоидный ретикулоз, кожный лейшманиоз). Очевидна перспективность применения липосомальных форм антипаразитарных препаратов также для лечения малярии и токсоплазмоза. Актуальной представляется и проблема инкапсулирования в липосомах и внутриклеточного введения нуклеиновых кислот.

В ряде лабораторий получены удовлетворительные результаты по включению нативной ДНК или РНК в липосомы, разработаны липосомальные формы противоопухолевых препаратов, таких как метотрексат, доксорубицин, винкристин, винбластин, актиномицин, L-аспарагиназа, противогрибкового препарата амфотерицин В, ряда пептидов, полиеновых антибиотиков, противовоспалительных кортикостероидных препаратов — кортизона, гидрокортизона, дексаметазона; бычьего инсулина и некоторых других препаратов.

Литература

Gregoriadis. G. (1995) TIBECH. 13, 527-537.

Yurasov V.V., Kucheryanu V.G.,. Kryzhanovsky G.N,. et al. (1996) Progress in Drug Delivery Systems. Biomedical Research Foundation, Tokyo. Eds. Sadao Hirota, 5, 171-174.

Kucheryanu V.G., Yurasov V.V., Kryzhanovsky G.N., et al. (1996) Progress in Drug Delivery Systems. Biomedical Research Foundation, Tokyo, Eds. Sadao Hirota, 5, 179-182.

Юрасов В.В., Подгорный Г.Н., Кучеряну В.Г., и др. (1996) Бюллетень эксперим. биол. мед., 122, 614-617.

Юрасов В.В., Кучеряну В.Г., Кудрин В.С., и др. (1997) Бюллетень эксперим. биол. мед., 123, 150-153.

Maeda H., Matsumura Y. (1989) Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 6, 193-210.

Seymour L.V. (1992) Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 6, 135-187.

Jain R.K. (1987) Cancer Metastasis Rev. 6, 559-593.

Huang S.K., Mayhew E., Lasic D.D., et al. (1992) Cancer Res. 52, 6774-6781.

Дранов А.Л., Дудниченко А.С., Бутенко К.А., Краснопольский Ю.М. (1994) Вестн. фармации, №3-4, С. 88-92.

Дранов А.Л., Дудниченко А.С., Мезин И.А., и др. (1996) Бюлл. экспер. биол. мед., № 8, 85-89.

Дудниченко А.С., Краснопольский Ю.М. (1996) Бюлл. экспер. биол. 18, 125-129.

Дудниченко А.С., Краснопольский Ю.М. (1996) Бюлл. экспер. биол. 18, 392-396.

Janoff A.S. (1992) Lab. Invest. 66, 655-658.

Gabizon A., Catane R., Uziely B., et al. (1994) Cancer Res. 54, 987 992.

Gill P.S., Espina B.M., Muggia F., et al. (1995) J. Clin. Oncol. 13, 996-1003.

Forssen E.A., Ross M.E. (1994) J. Lipisomes Res. 4, 481-512.

Northfelt D.W., Kaplan L., Russell J., et al. (1995) in Stealth Liposomes (Lasic D.D., Martin F.J., eds). 257-266. CRC Press.

Bogner J. R., Goebl F-D. (1995) in Stealth Liposomes (Lasic D.D., Martin F.J., eds). CRC Press. 267-278.

Blum G., Cevc G. (1990) Biochim. Biophys. Acta, 1029, 91-97.

Klibanov A.L., Maruyama K., Torchilin V.V., Huang L. (1990) FEBS Letters., 268, 235-237.

Senior J., Delgado C., Fisher D., et al. (1991) Biochim. Biophys. Acta. 1062, 77-82.

Papahadjopouluos D., Allen T.M., Gabizon A., et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 11460-11464.

Allen T.M., Hansen C. (1991) Biochim. Biophys. Acta. 1068, 133-141.

Torchilin V.P., Omelyanenko V.G., Papisov M.I., et al. (1994) Biochim. Biophys. Acta, 1195, 11-20.

Torchilin V.P., Shtilman M.I., Trubetskoy V.S., et al. (1994) Biochim Biophys Acta, 1195, 181-184.

Gluck R. (1995) In Vaccine Design: The sub>mit and Adjuvant Approch (Powell M.F., Newman M.J., eds)., Plenum Press. P. 325-345.

Le Bang Son, Kaplun A.P., Symon A.V., et al. (1998) J. Liposome Research. 8, 78.

Torchilin V.P. (1998) J. Microencapsul, 15, 1-19.

Muller R.H., Ruhl D., Runge S., et al. (1997) Pharm. Res. 14 458-462.

Yuan F. (1998) Semin. Radiat. Oncol. 8, 164-175.

Wiedmann T. S. DeCastro L. Wood R.W. (1997) Pharm. Res. 14, 112-116.

Muller R.H., Peters K., Becker R., Kruss B. (1996) Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 22, 574-575.

Bohm B.H.L., Grau M.J., Hildebrand G.E., et al. (1998) Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 25, 956-957.

Allen T.M. (1997) Drugs, 54, Suppl. 4, P. 8-14.

Torchilin V.P. (1996) Mol. Med. Today, 2, 242-249.

Torchilin V.P. (1996) J. Mol. Recognit. 9, 335-346.

Dass C.R., Walker T.L., Burton M.A., Decruz E.E. (1997) J. Pharm. Pharmacol. 49, 972-975.

Aliсo S.F. (1997) Biochem. Pharmacol. 54, 9-13.

Жданов Р.И. Куценко Н.Г. Федченко В.И. (1997) Вопр. мед. химии 43, 3-12

Тараховский Ю.С., Иваницкий Р.Г. (1998) Биохимия. 63, 723-736.

Yang K., Clifton G.L., Hayes R.L. (1997) J. Neurotrauma. 14, 281-297.

Hirnle P. (1997) Hybridoma. 16, 127-132.

Rongen H.A., Bult A., van Bennekom W.P. (1997) J. Immunol. Methods. 204, 105-133.

Devine D.V., Marjan J.M. (1997) Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14, 105-131.

Imai E., Isaka Y., Akagi Y., Kaneda Y. (1997) Exp. Nephrol. 5, 112-117.

Morishita R., Higaki J., Aoki M., et al. (1996) Contrib. Nephrol. 118, 254-264.

Schmid M.H., Korting H.C. (1994) Crit. Rev. in Ther. Drug Carrier Syst., 11, 97-118.

Sharata H.H., Katz K.H. (1996) Int. J. Dermatol., 35, 761-769.

Cevc G., Crit. Rev. (1996) Ther. Drug Carrier Syst., 13, 257-388.

Yuan F., Dellian M., Fukumura D.F. et al. // Cancer Res. 1995. V. 55. P. 3752.

Lasic D.D., Papahadjopoulos D. // Science. 1995. V. 267. P. 1275.

Gabizon A., Schmeeda H., Barenholz Y. // Clin. Pharmacokinet. 2003. V. 42. P. 419.

Водовозова Е.Л., Никольский П.Ю., Михалев И.И. и др. // Биоорган. химия. 1996. Т. 22. С. 548.

Водовозова Е.Л., Евдокимов Д.В., Молотковский Юл.Г. // Биоорган. химия. 2004. Т. 30. С. 663.

Водовозова Е.Л., Кузнецова Н.Р., Кадыков В.А. // Рос. нанотехнологии. 2008. Т. 3. С. 162.

Alberts D.S., Muggia F.M., Carmichael J. et al. // Semin. Oncol. 2004. V. 31. P. 53.

Kuznetsova N., Kandyba A., Vostrov I. et al. // J. Drug Deliv. Sci. Technol. 2009. V. 19. P. 51.

Козлов А.М., Корчагина Е.Ю., Водовозова Е.Л. и др. // Бюлл. экспер. биол. мед. 1997. Т. 123. С. 439.

Vodovozova E.L., Moiseeva E.V., Grechko G.K. et al. // Eur. J. Cancer. 2000. V. 36. P. 942.

Torchilin VP. (2006)Adv Drug Deliv Rev. 2006 Dec 1;58(14):1532-55

Kimball's Biology Pages, "Cell Membranes."

Stryer S. (1981) Biochemistry, 213

Barani, H. & Montazer, M. (2008) A Review on Applications of Liposomes in Textile Processing. Journal of Liposome Research, 18 (3) 249-262

Meure, L.A., Knott, R., Foster, N.R., Dehghani, F. (2009) The Depressurization of an Expanded Solution into Aqueous Media for the Bulk Production of Liposomes. Langmuir, 25, 326-337

L Zhang, FX Gu, JM Chan, AZ Wang, RS Langer and OC Farokhzad (2008). "Nanoparticles in Medicine: Therapeutic Applications and Developments". Clinical Pharmacology and Therapeutics 83 (5): 761-69. doi:10.1038/sj.clp t.6100400. PMID 17957183. http://www.nature.com/clpt/journal/v83/n5/full/6100400a.html.

Gomez-Hens, A., Fernandez-Romero, J.M. (2006). Analytical methods for the control of liposomal delivery systems. Trends Anal Chem 25:167–178.

Mozafari, M.R., Johnson, C., Hatziantoniou, S. & Demetzos, C. (2008) Nanoliposomes and their applications in food nanotechnology. Journal of Liposome Research. 18 (4), 309-327.

Mozafari, M.R. & Mortazavi, S.M. (2005) Nanoliposomes: From Fundamentals to Recent Developments. Trafford Publishing Ltd, Oxford, UK.

Colas, J.C., Shi, W.L., Rao, V.S.N.M., Omri, A., Mozafari, M.R., Singh, H. (2007) Microscopical investigations of nisin-loaded nanoliposomes prepared by Mozafari method and their bacterial targeting. Micron 38:841–847.

Lasic D.D., Papahadjopoulos D. Liposomes revisited: Science. 1995; 267: 1275–6.

Harrington K.L., Lewanski C.R., Stewart S.W. Liposomes as vehicles for targeted therapy of cancer/Part.2: Clinical development. Clin Oncol 2000; 12: 16–24.

Maruyama К. In vivo targeting by liposomes. Biol Pharm Bull 2000; 23: 791–9.

Wright S., Huang L. Advanced Drug Delivery Rev 1989; 3: 343–40.

Torchilin V.P., Klibanov A.L., Huang L. et al. Targeted accumulation of polyethylene glycol-coated immunoliposomes in infarcted rabbit myocardium. FASEB J 1992; 6: 2716–9.

Torchilin V.P., Papisov M.I., Bogdanov A.A. et al. Molecular mechanissm of liposome and immunoliposome steric protection with poly(ethylene glycol) in "Stealth Liposomes". D.Lasic, F.Martin (Eds), P.51-62. CRC Press<Boca Raton. FL. 1995.

Alien T.M., Brandeis E., Hansen C.B. et al. A new strategy for attachment of antibodies to sterically stabilized liposomes resulting in efficient targeting to cancer cells. Biochim Biophys Acta 1995; 1237: 99–108.

Lopes de Menezes D.E., Pilarski L.M., Belch A.R., Alien T.M. Selective targeting of immunoliposomal doxorobicin against human multiple myeloma in vitro and ex vivo. Biochim Biophys Acta 2000; 1466 (1-2): 205–20.

Kirpotin D., Park J.W., Hong K. et al. Sterically stadilized anti-HER2 immunoliposomes: desin and targeting to human breast cancer cells in vitro. Biochemistry 1997; 36: 66–75.

Park J.W., Hong K., Kirpotin D.B., Papahandjopoulos C.C., Benz C.C. Adv Pharmacol 1997; 40: 399–435.

Papahadjopoulos D., Kilpotin D.B., Park J.W., Hong K., Yi Shao, Shalaby R., Colbern G., Benz C.C. Targeting of drugs to solid tumors using anti-HER2 immunoliposomes. J Liposome Research 1998; 8 (4): 425–42.

Dufresne I., Desormeaux A., Bestman-Smith J., Gourde P., Tremblay M.J., Bergeron M.G. Targeting lymph nodes with liposomes bearing anti-HLA-GR Fab' fragments. Biochim Biophys Acta 1999; 1421 (2): 284–94.

Bestman-Smith J., Gourde P., Desormeaux A., Tremblay M.J, Bergeron M.G. Sterically stabilized liposomes bearing anti-HLA-DR antibodies for targeting the primary cellular reservoirs of HIV-1. Biochim Biophys Acta 2000; 1468 (1-2); 161–74.

Lundberg B.B., Griffiths G., Hansen H.J. Specific binding of sterically stabilized anti-B-cell immunoliposomes and cytotoxicity of entrapped doxorubicin. Int J Pharm 2000; 205 (1-2): 101–8.

Merrcadal M., Domingo J.C., Petriz J., Garcia J., de Madariaga M.A. Preparation of immunoliposomes bearing poly(ethylene glycol)-coupied monoclonal antibody linked via a clevable disulfide bond for ex vivo applications. Biochim Biophis Acta 2000; 1509: 299–310.

Park S., Durst R.A Immunoliposoine sandwich assay for the detection of Escherichia coli 0157:H7. Anal Biochem 2000; 280 (1): 151–8.